课题组前期在GH12家族葡聚糖酶Cel12B中入GH11家族酶的Thumb结构,获得突变体酶17QT,很好的保留了GH12家族酶的热稳定性,对木聚糖底物水解产生的木二糖、木三糖和木四糖含量增加,但17QT对CMC（羧甲基纤维素钠盐）和BWX（山毛榉木聚糖）两种底物的亲和能力和酶的催化能力下降。由于构建的17QT的Thumb结构来源于中低温黒曲霉,而17QT在100℃条件下仍有很好的稳定性,高温条件下可能不适于中低温来源的Thumb结构行使功能。本研究通过对GH11家族Thumb结构的筛选比对,并进行Thumb结构的氨基酸定点突变,探究对Thumb降解木聚糖底物的关键氨基酸位点。对17QT中Thumb中确定的关键氨基酸位点进行单点突变和多点组合突变,获得葡聚糖酶对木聚糖底物亲和、水解能力提高。从嗜热菌来源酶的Thumb结构氨基酸序列比对,依据Thumb结构序列的高度保守性,确定Thumb结构上三个突变位点和与Thumb末尾连接处突变位点。在GH11家族木聚糖酶23A2的Thumb结构进行氨基酸单点突变,构建了4个突变体E119Q、T123E、S126T、T129D。在葡聚糖酶17QT中对Thumb结构上三个突变位点进行单点突变和多点组合突变,构建了7个突变体E177Q、T181E、S184T、E177Q-T181E、T181E-S184T、E177Q-S184T和三点突变。对Thumb结构突变体酶学性质检测结果如下:木聚糖酶Thumb结构突变体纯酶性质检测（1）突变体E119Q、T123E、S126T、T129D最适p H为4.2、4.0、4.0、4.4,相对于23A2最适p H3.8由酸性趋向中性。（2）最适温度检测中,23A2最适温度为50℃,突变体E119Q、T123E、T129D的最适温度都为50℃,这三个点的突变对酶对最适温度无明显影响,而S126T的最适温度为45℃,最适的温度的降低,表明该突变会对酶的温度适应性有影响。（3）在50℃条件下,23A2、E119Q、T123E、S126T、T129D的半失活时间依次是23.1min、15.4 min、6.3 min、7.0 min、9.3 min,半衰期检测显示点突变后酶半衰期变短。（4）酶促动力学检测中,反应速度最快的是T129D,V_max为10.3μmol·L^-1·s^-1,是23A2的1.48倍。与23A2的K_m3.4相比,突变体E119Q、T123E、T129D对底物亲和能力都有所提高,K_m值依次为3.0、2.9、3.3,底物亲和力最高的是T123E,是23A2的1.167倍。证明Thumb这些位点的突变可以提高对木聚糖底物亲和力。葡聚糖酶Thumb结构突变体粗酶性质检测（1）7个突变体粗酶最适p H和温度检测时与17QT粗酶结果一致,最适p H都为6.0,最适反应温度都为100℃。在100℃条件下检测粗酶半失活时间,E177Q、T181E、S184T、E177Q-T181E、T181E-S184T、E177Q-S184T、三点全突变半失活时间依次为58 min、54 min、33 min、214 min、81 min、82 min、150 min,对比17QT粗酶检测在100℃的半失时间为65min,由此可见突变体与17QT在粗酶半失活时间相比,突变体很好的保留了原有葡聚糖酶的p H广泛性和良好的热稳定性,而且而双点和三点突变后,粗酶半失活时间长于17QT,表现出更好的的热稳定性。（2）在突变体对CMC和BWX底物活性比较中发现,单点突变体底物活性与17QT接近,双点和三点全突变体粗酶检测活性的OD₅₅₀,CMC底物活性明显降低,OD₅₅₀由高于0.4降至低于0.1,由单点突变中高于BWX,变为低于BWX。双点和三点全突变体中,CMC底物活性明显降低,BWX/CMC活性的相对值增大了5至7倍,对BWX底物活性增强。（3）在突变体粗酶的相对比活中发现,单点突变体中,比活最高的是T181E,双点突变体中E177Q-T181E、T181E-S184T突变活性活性无明显增加,T181E-S184T突变体比活降低,三点突变是所有相对比活最高的。由此可见,单点突变体在活性显示与17QT相近的性质,多点组合突变,在具有17QT的良好热稳定性上,对木聚糖底物的亲和降解能力得到提升。在Thumb结构三个氨基酸位点中,三个位点对葡聚糖降解木聚糖底物起着关键作用,它们的组合突变更利于发挥Thumb结构提高对木聚糖底物的亲和与水解能力,三个不同位置的氨基酸突变位点之间存在一定的叠加增益能力,突变体在进行多点组合突变后对于CMC和BWX水解能力发生改变,更利于提高木聚糖底物亲和降解能力。本研究通过对GH11家族木聚糖酶特异性元件Thumb结构中关键氨基酸的突变,葡聚糖酶获得对木聚糖底物亲和、水解能力的提高,为对葡聚糖酶底物特异性改造提供了新方向,也为酶的改良提供了一种新的方法。