过表达microRNA-17-5p对结肠癌HCT116细胞生物学功能的影响

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MicroRNA是一类在基因转录后起调控作用的非编码小分子RNA,在很多肿瘤演进过程中起到关键的作用。人类肿瘤相关的小分子RNA中,microRNA-17-92家族是较早被发现的microRNA家族。microRNA-17-5p是其家族的重要成员,参与调控人体多个系统肿瘤的演进,并在多种恶性肿瘤组织中异常表达。结肠癌是人类常见的恶性肿瘤之一,其发生是多种致癌因素、多个癌基因相互作用的复杂过程。目前,microRNA-17-5p在结肠癌发病过程中作用机制尚未明确。目的:研究microRNA-17-5p对结肠癌细胞株HCT116生物学行为的影响,探讨microRNA-17-5p在结肠癌的发生发展过程中的作用机制,预测和印证其在结肠癌中的作用靶点。方法:1.选取人结肠癌细胞株HCT116进行细胞培养作为体外细胞实验模型。对HCT116细胞分别进行microRNA-17-5p模拟物(mimics)和阴性对照(mimics negative control、NC)转染,将转染mimics组作为实验组,将转染mimics control作为阴性对照组,构建过表达microRNA-17-5p的细胞模型。2.实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative reverse transcription-PCR,q RT-PCR)检测转染48h后microRNA-17-5p的相对表达以及转化生长因子β受体II(Transforming growth factor-βreceptor II,TGFBR2)在核酸水平的相对表达。3.CCK-8实验方法检测细胞转染24h、48h、72h和96h四个时段的OD值,绘制细胞生长曲线,比较实验组和阴性对照组间细胞增殖的改变情况。4.流式细胞术观察过表达microRNA-17-5p后,采用AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡的数量。5.Transwell小室实验方法检测过表达microRNA-17-5p后,细胞侵袭和迁移能力的改变。6.划痕愈合实验方法观察过表达microRNA-17-5p后,细胞划痕愈合能力的变化。7.生物信息学预测分析软件预测mi RNA-17-5p可能的候选靶基因。免疫印迹法(Western blot)检测细胞转染48h后,转化生长因子β受体II(Transforming growth factor-βreceptor II,TGFBR2)在蛋白水平的表达。结果:1.q RT-PCR检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组较阴性对照组microRNA-17-5p表达量明显上调(P=0.0001);TGFBR2表达量明显下调(P=0.01)。2.CCK-8实验检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组细胞的吸光度较阴性对照组明显升高(P=0.01、0.02、0.01)。3.流式细胞术检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组细胞的早期凋亡数目较阴性对照组明显减少(P=0.002)。4.Transwell小室实验检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组细胞的侵袭及迁移细胞数目较阴性对照组明显增多(P=0.04、0.004)。5.划痕愈合实验检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组划痕的愈合率较阴性对照组明显增快(P=0.04、0.03、0.04)。6.生物信息学方法预测mi RNA-17-5p可能的靶基因为TGFBR2。Western blot检测结果:分别转染microRNA-17-5p mimics和mimics control后,实验组较阴性对照组TGFBR2蛋白水平表达明显降低(P=0.03)。结论:1.在结肠癌HCT116细胞中,上调microRNA-17-5p的表达,可以有效促进细胞的增殖、侵袭和迁移能力,并抑制细胞早期凋亡,提示microRNA-17-5p可促进结肠癌细胞的发生、发展和转移,可为结肠癌的发病机制研究提供依据。2.在结肠癌HCT116细胞中,上调microRNA-17-5p的表达,可以明显降低其靶基因TGFBR2的表达,表明microRNA-17-5p可通过沉默TGFBR2发挥其生物学作用,有潜力成为治疗结肠癌的新靶点。
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