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[目的]从胰岛细胞增殖、凋亡相关的易感因素、细胞因子及相关调控蛋白等方面来探讨老年糖尿病增殖与凋亡的分子病理学机制及石斛合剂的调整作用。
[方法]Wistar大鼠腹腔注射D-半乳糖40天制作衰老模型大鼠；同时加灌高脂高糖乳剂及注射低剂量STZ制作衰老DM模型大鼠；采用氧化酶法检测大鼠血糖、血脂含量；比色法检测血FFA含量；黄嘌呤氧化酶和TBA法检测血SOD活性和MDA含量；放免法检测大鼠血胰岛素、胰高血糖素、TNF-α含量；ELISA法检测血GLP-1含量；免疫组化法检测胰腺细胞凋亡和PCNA、iNOS的表达；RT-PCR法检测胰腺组织p53、bax、bcl-2和pdx-1mRNA表达；Westernblotting法检测胰腺组织P53、Bax和Bcl-2蛋白表达；光镜、电镜观察胰腺组织形态和超微结构变化；以及石斛合剂对衰老大鼠和衰老DM大鼠上述各项指标变化的影响。
[结果]1.血生化检测显示：(1)与正常对照组比较，衰老模型大鼠血HDL含量、SOD活性、胰岛素和GLP-1水平明显降低，FFA、胰高血糖素和MDA含量显著增高，而禁食血糖、TC、TG、LDL和TNF-α含量变化不明显；衰老DM模型大鼠禁食血糖、TC、TG、LDL、FFA、胰高血糖素、MDA、TNF-α明显升高；而HDL、胰岛素、SOD和GLP-1显著降低。(2)与衰老模型对照组比较，衰老石斛合剂组SOD、胰岛素和GLP-1明显升高，而MDA、胰高血糖素、FFA则显著降低。与衰老DM对照组比较，衰老DM石斛合剂治疗组禁食血糖、TC、TG、LDL、MDA、胰高血糖素、FFA、TNF-α明显降低，而SOD、胰岛素和GLP-1则显著升高。
2.免疫组化和TUNEL法分析显示：(1)与正常对照组比较，衰老模型大鼠和衰老DM模型大鼠胰岛iNOS和胰腺细胞凋亡均显著增加，且衰老DM模型大鼠增加更明显，而各组PCNA表达无统计学差异。(2)与相应对照组比较：衰老石斛合剂组和衰老DM石斛合剂治疗组胰岛iNOS和胰腺细胞凋亡均明显减少、而PCNA显著增加，其中衰老DM石斛合剂治疗组变化更显著。
3.应用RT-PCR及Western-Blotting两种方法检测显示：(1)与正常对照组比较，衰老模型大鼠和衰老DM模型大鼠pdx-1mRNA表达明显下降，P53、BaxmRNA及其蛋白表达显著增加；而对于Bcl-2，衰老模型大鼠变化不明显，而衰老DM模型大鼠则显著下降。(2)与相应对照组比较：衰老石斛合剂组和衰老DM石斛合剂治疗组pdx-1mRNA表达明显增加，P53和BaxmRNA和蛋白表达显著下降；同时石斛合剂能够增加衰老大鼠和衰老DM大鼠Bcl-2mRNA及其蛋白表达，但以衰老DM石斛合剂治疗组增加更显著。
4.胰腺组织光镜、电镜观察显示：(1)与正常对照组比较，衰老模型大鼠胰腺细胞皱缩，胰岛数量、胰岛面积明显下降(尚未低于正常50％)；衰老DM模型大鼠胰岛数量、面积减少更明显(为正常20～30％)，且岛内细胞明显空泡化，数量显著减少。电镜显示胰岛细胞空泡变性，分泌颗粒大量减少，腺泡细胞核膜皱缩，呈现细胞凋亡征象。(2)与相应对照组比较：衰老石斛合剂组胰岛数量、面积明显增加，岛内细胞排列规则、整齐，细胞形态与正常对照组类似；衰老DM石斛合剂治疗组胰岛数量、面积、形状以及岛内细胞排列均较衰老DM对照组改善。
[结论]1.采用D-半乳糖腹腔注射+高脂高糖+STZ(30mg/kg)腹腔注射法可以制作一种较为理想的衰老糖尿病模型。
2.胰岛细胞的增殖和凋亡是增殖、凋亡相关的易感因素、细胞因子及相关调控蛋白的综合作用结果，其中FFA、GLP-1、PDX-1、PCNA、iNOS、P53、Bax、Bcl-2在衰老、衰老DM大鼠胰岛细胞增殖与凋亡调控中起着重要作用。其中凋亡异常增多和β细胞增殖下降及分化成β细胞障碍在老年糖尿病中尤为突出，可能是老年糖尿病的主要分子病理学机制。
3.石斛合剂降低衰老DM大鼠血糖、血脂，调整胰岛β细胞增殖与凋亡失衡，防治老年糖尿病的作用机制，一方面可能与其提高SOD、降低MDA，改善局部和整体内环境，抑制凋亡易感因素TNF-α、FFA、ROS和NO过多生成，进而减少Bax、P53表达，增加Bcl-2表达，抑制胰岛细胞凋亡有关；另一方面可能与其调整肠道L细胞功能，改善GLP-1分泌，促进PDX-1表达，进而调整胰岛素/胰高血糖素分泌、促进胰岛β细胞增殖有关。