膀胱癌(bladder cancer, BC)是世界上发病率第六位的恶性肿瘤,在我国是最常见的泌尿系统恶性肿瘤,其中尿路上皮癌(urothelial cell carcinoma, UCC)占90%左右,是膀胱癌主要的组织学类型。膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cell carcinoma, BUCC)的显著特点是大约75-85%的初发病例都是表浅性肿瘤(Tis,Ta,T1),超过50%的患者会出现术后复发,除此之外,约40%的患者其肿瘤的恶性程度会增加,而最终将有30%的患者将死于膀胱癌。BUCC的高复发率和进展性、术后的膀胱灌注化疗和全身化疗以及长期甚至终身的随访观察,无疑给患者带来身心上的巨大痛苦、增加其医疗费用,也给国家的医疗卫生事业增加了巨大的经济和社会负担。目前BUCC的诊断和监测主要依靠膀胱镜、尿脱落细胞学(urine cytology)等检查手段,膀胱镜检查属于有创性检查,不可避免的会给患者造成创伤和痛苦,而尿脱落细胞学的阳性率极低,几乎不能作为一个较敏感和适宜的早期诊断的指标；在治疗方面,传统的手术治疗和辅助化疗的效果欠佳,BUCC的治疗期待着更有效的方案。因此,研究BUCC发生发展的分子生物学以及遗传学机制,从分子水平上揭示膀胱癌的发生、发展及转移机制,探索BUCC的早期诊断、预后估计的无创性敏感指标以及基因靶向治疗的理论基础和可能方案,从而提高膀胱癌的临床诊疗水平,是泌尿外科临床和科研上急需解决的热点和重要课题。近年来,研究发现肿瘤抑制基因(即抑癌基因,tumoursuppressor gene, TSG)启动子区CpG岛(CpG island, CGI)甲基化是该基因失活的重要机制,能使该基因的转录受到抑制,被认为与许多恶性肿瘤发生发展有重要联系。CpG岛异常甲基化是Knudson’s“二次打击论”的重要内涵,也是表观遗传学研究的重要内容之一。死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase, DAPK)基因是肿瘤抑制基因之一,定位于染色体9q34.1,是一种钙离子(Ca2+)/钙调蛋白(CaM)依赖性的丝/苏氨酸蛋白激酶,可通过一系列通路参与诱导凋亡的正向调节,在凋亡途径中起重要作用。DAPK在多种肿瘤细胞和组织中表达缺失,且该表达缺失与其CpG岛的甲基化改变密切相关,因此被认为与多种肿瘤的发生发展相关。国外学者研究发现膀胱癌组织和细胞中DAPK表达低下或缺失,而其基因启动子的甲基化水平则明显高于正常膀胱粘膜组织和细胞,在膀胱癌患者的尿液标本中可检测到DAPK基因启动子的甲基化,且其敏感度优于尿脱落细胞学检查。国内学者胡礼炳等和赵敏等分别研究DAPK启动子甲基化状态与膀胱癌的关系,得出的结论却基本相反。胡礼炳等认为DAPK的表达与膀胱癌的发生发展有重要联系,并且基因启动子CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中发挥重要作用,DAPK基因的甲基化与肿瘤浸润和复发有显著的相关性,提示DAPK甲基化可以作为肿瘤预后的一个分子指标；而赵敏等认为DAPK基因启动子在膀胱癌中的甲基化阳性率较低,且与膀胱癌的分级、分期无相关性,因而在选择分子生物学指标辅助膀胱癌早期诊断时,DAPK的甲基化检测需慎用。本研究在临床标本与体外细胞两个水平研究膀胱尿路上皮癌DAPK基因的表达及其启动子异常甲基化的意义及其机制,探讨DAPK与BUCC的发生发展是否相关、DAPK作为BUCC的早期诊断和预后估计的敏感指标,以及基因靶向治疗的理论基础和可能方案。本研究分为三个部分：第一部分采用Western-blot, RT-PCR和MS-PCR分别检测膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱粘膜上皮组织中DAPK, DAPK mRNA的表达,以及DAPK基因启动子CpG岛的甲基化状态,探究DAPK基因的表达与甲基化改变与BUCC的关系及其机制,以及与BUCC(?)中瘤临床特点之间的关系。第二部分选择人尿路上皮癌细胞5637进行体外实验,将5637细胞分为2组,即膀胱尿路上皮癌细胞5637组(对照组)和膀胱尿路上皮癌细胞5637+5-Aza-CdR处理组(观察组),分别采用Western-blot方法、RT-PCR方法定量检测对照组和观察组中DAPK、 DAPK mRNA的表达,并采用MS-PCR方法检测对照组和观察组中DAPK基因启动子CpG岛的甲基化状态,分析膀胱尿路上皮癌细胞中DAPK基因启动子CpG岛的甲基化状态。第三部分采用流式细胞术和肿瘤细胞侵袭实验分别检测膀胱尿路上皮癌细胞5637组(对照组)及膀胱尿路上皮癌细胞5637+5-Aza-CdR处理组(观察组)的细胞凋亡率及细胞侵袭能力,研究DAPK基因与肿瘤细胞的生物学功能之间的关系。第一部分DAPK基因的表达及其启动子甲基化改变在人膀胱尿路上皮癌组织中的意义目的：分析DAPK基因的表达及其启动子甲基化改变在人膀胱尿路上皮癌组织中的意义。方法：采用Western-blot方法定量检测膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱粘膜上皮组织中DAPK的表达,采用RT-PCR方法定量检测膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱粘膜上皮组织中DAPK mRNA的表达,并采用MS-PCR方法检测膀胱尿路上皮癌组织和正常膀胱粘膜上皮组织中DAPK基因启动子CpG岛的甲基化状态。结果：Western-blot险测结果发现DAPK在BUCC组织中表达显著低于正常组织(P<0.01),且DAPK的表达与肿瘤的分级、分期无显著相关性。RT-PCR检测结果发现DAPK mRNA在BUCC组织中表达显著低于正常组织(P<0.01),且与肿瘤的分级分期无显著相关性,与Western-blot检测的DAPK表达结果一致。MS-PCR检测结果发现在BUCC组织中有16例检测到DAPK基因启动子CpG岛的甲基化改变(16/21,76.2%),在正常组织中有4例检测到DAPK基因启动子CpG岛的甲基化改变(4/20,20%),两者之间具有显著性差异(P<0.01)。DAPK基因的甲基化改变与肿瘤病理分级、临床分期无显著相关性,但与肉眼血尿有关(P<0.05)。结论：(1)DAPK基因的表达缺失及其启动子CpG岛的甲基化与BUCC的发生密切相关。(2)DAPK基因启动子CpG岛的甲基化与肉眼血尿有显著的相关性,提示具有肉眼血尿的患者可能预后不良。第二部分人膀胱尿路上皮癌细胞中DAPK基因的表达及其启动子甲基化状态的研究目的：研究人膀胱尿路上皮癌细胞中DAPK基因的表达及其启动子甲基化状态,以及5-Aza-CdR对DAPK基因甲基化状态的影响。方法：本实验选择人膀胱尿路上皮癌细胞5637进行体外实验。将5637细胞分为2组,即膀胱尿路上皮癌细胞5637组(对照组)和膀胱尿路上皮癌细胞5637+5-Aza-CdR处理组(观察组),分别采用Western-blot方法、RT-PCR方法定量检测对照组和观察组中DAPK、DAPK mRNA的表达,并采用MS-PCR方法检测对照组和观察组中DAP(?)基因启动子CpG岛的甲基化状态。结果：对照组5637细胞中DAPK、DAPK mRNA的表达水平极低,启动子CpG岛甲基化状态为阳性,而观察组5637细胞中DAPK, DAP(?) mRNA的表达水平明显增高,启动子CpG岛甲基化状态为阴性。结论：(1)DAPK基因的表达异常与膀胱尿路上皮癌细胞关系密切,且基因启动子CpG岛的异常甲基化在调节DAPK基因的表达中起重要作用。(2)5-Aza-CdR可以抑制基因的甲基化,从而逆转基因的表达,提示其可能作为一种治疗肿瘤的基因靶向治疗药物。第三部分人膀胱尿路上皮癌细胞DAPK基因启动子甲基化状态与生物学功能之间的关系分析目的：探讨人膀胱尿路上皮癌细胞DAPK基因启动子甲基化状态与生物学功能之间的关系。方法：采用流式细胞术和肿瘤细胞侵袭实验分别检测膀胱尿路上皮癌细胞5637组(对照组)及膀胱尿路上皮癌细胞5637+5-Aza-CdR处理组(观察组)的细胞凋亡率及细胞侵袭能力。结果：流式细胞术检测结果发现观察组的细胞凋亡率较对照组显著增高。肿瘤细胞侵袭实验检测结果发现观察组的细胞侵袭能力较对照组明显提高,结果具有统计学意义(P<0.05)。结论：(1)DAPK可以促进膀胱尿路上皮癌细胞凋亡。(2)DAPK可以抑制膀胱尿路上皮癌细胞的侵袭(迁移)能力。(3)5-Aza-CdR能通过上调DAPK表达促进膀胱尿路上皮癌细胞凋亡,而且能抑制肿瘤细胞的转移。