寡肽转运体 POTs(proton-coupled oligopeptide transporters)是利用质子的动力和负膜电位介导一系列短链肽和拟肽类物质的细胞转运膜蛋白,包括PEPT1,PEPT2,PHT1,PHT2和SLC15A5等家族成员。所有成员都被预测含有12个跨膜结构域,且N端和C端朝向细胞质。大多数的研究集中在PEPT1和PEPT2,它们分别主要表达在小肠和肾小管上皮细胞膜顶侧,负责对寡肽类和肽类似药物的摄取。相比于PEPT1和PEPT2,PHT1和PHT2的研究报道较少,PHT1主要表达在脑和视网膜中,PHT2主要表达在肺、脾和胸腺中,二者均定位表达于细胞内溶酶体膜,介导寡肽和组氨酸的转运,其底物的进一步相关信息鲜有报道。炎症是机体对于有害物质的刺激或有害环境(如感染和组织损伤)的适应性反应,是固有免疫的一种机制。炎症反应的触发主要依赖于固有免疫系统受体对微生物的识别,这些受体包括toll样受体(TLR)和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体。多项研究显示,寡肽转运体可能与炎症的发生发展相关。PEPT1可以介导细菌的肽类似产物L-Ala-y-D-Glu-meso-二氨基庚二酸(tri-DAP)和胞壁酰二肽(MDP)的转运,从而激活NOD受体依赖的信号通路,导致促炎因子的释放。PHT1被发现高表达于免疫细胞群中,并且通过Toll-like受体9(TLR9)和NOD1信号通路加剧肠炎的固有免疫应答。PHT1还与糖尿病、系统性红斑狼疮的发病机制相关联,预示着PHT1在固有免疫系统中扮演着重要角色。然而PHT2的生理作用和药物相关性还存在很大的未知性。组织分布显示,PHT2主要表达在肺、脾和胸腺等淋巴系统,且在巨噬细胞中表达显著。我们前期实验发现,脂多糖(LPS)可以上调PHT2的表达,而不影响家族其他转运体的表达,提示PHT2的表达和调控可能与炎症相关,因此研究PHT2在炎症病理过程中的调控和功能,可以更好地了解PHT2的生理功能,也为炎症性疾病(如炎症性肠炎)的发病机制和治疗提供更多思路。1.脂多糖(LPS)诱导的急性炎症对PHT2的表达调控及机制研究本章研究目的是阐明PHT2在巨噬细胞和小鼠组织中的表达情况,并探讨脂多糖(LPS)诱导的急性炎症对PHT2的调节作用。mRNA结果显示,PHT2在J774A.1和THP-1巨噬细胞中表达较高。在小鼠的组织分布中,mRNA和蛋白结果均表明PHT2高表达于肺和脾脏组织中。我们发现LPS能使人巨噬细胞系THP-1和小鼠巨噬细胞系J774A.1中的PHT2表达上调2倍左右,且该现象能分别被NF-κB和MAPK信号通路的特异性抑制剂逆转。在LPS诱导的小鼠急性炎症模型中,通过对小鼠脾脏中PHT2 mRNA和蛋白的检测,结果与体外实验结果相似,即LPS显著上调了小鼠脾脏中PHT2的表达,且该上调作用亦能被NF-κB和MAPK特异性抑制剂逆转。上述结果表明,PHT2高表达于巨噬细胞、小鼠免疫器官和肺中,LPS通过激活NF-κB信号通路和MAPK信号通路诱导PHT2表达。2.葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织及结肠固有层免疫细胞中POTs表达的变化许多研究指出POTs在炎症性肠病和免疫细胞信号传导的起始或进程中发挥了作用。基于上述考虑,本章主要阐述小鼠结肠组织和结肠免疫细胞中POTs的表达,并使用化学试剂诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型来表征POTs,特别是PHT2,在结肠炎状态下的调控和潜在作用。通过分离小鼠近端结肠、远端结肠、结肠上皮细胞、结肠固有层单核细胞群(LPMC)及亚型CD11b+巨噬细胞,考察POTs的mRNA和蛋白表达情况。我们发现仅PHT1和PHT2在结肠的LPMC中有蛋白表达,在结肠CD11b+巨噬细胞中未观察到任何POTs的蛋白表达。此外,PHT1在LPMC中的表达较低,且在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠的近端和远端结肠中表达下调。相反,PHT2蛋白在结肠中表达中等,并在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的远端结肠和LPMC中表达上调。PEPT1蛋白在正常小鼠和结肠炎小鼠的各个结肠节段,细胞或亚型中均不表达。将分离的LPMC给予外源性刺激物LPS、tri-DAP或MDP,以及PHT2的经典底物组氨酸和肌肽,考察PHT2在LPMC免疫应答中的作用。结果发现无论是LPS还是tri-DAP或MDP,都不能引起LPMC显著的免疫应答,且加入的PHT2底物不能抑制LPS、tri-DAP或MDP上调的炎症因子。上述结果提示,外源性地给予LPMC炎症刺激物,PHT2可能不参与其中的免疫应答。3.稳定表达hPHT2细胞模型的构建及其底物特性考察本章考察PHT2的底物转运功能,特别是考察细菌肽MDP和tri-DAP是否为PHT2的底物。PHT2在细胞内定位于溶酶体膜,使其底物研究较为困难。为研究PHT2的转运功能和底物特性,我们首先对hPHT2的蛋白序列进行突变,将19和20位亮氨酸突变为丙氨酸,破坏了定位表达在溶酶体膜的信号基序,使PHT2定位表达在细胞膜上。将构建成功的pcDNA3.1(+)-hPHT219,20AA-eGFP转染至MDCK细胞,经过筛选和验证获得稳定表达人PHT2的MDCK-hPHT219,20AA细胞。利用该细胞考察了 POTs相关底物,证明了 Gly-sar、伐昔洛韦、Gly-gly-gly、头孢羟氨苄是hPHT2的底物;5-ALA、卡托普利不是hPHT2底物;细菌肽MDP是PHT2底物,tri-DAP能够微弱地被PHT2转运。并获得了 d3-L-Histidine、Gly-sar和伐昔洛韦的积聚动力学参数,分别为1667±99,73.6±5.9,63.7±6.3(mVx,pmol/mg protein/min);73.75±14,428±88,5350±1200(Km,μM);22.6,0.17,0.012(Clint,Vmax/Km)。4.PHT2与细菌胞壁酰二肽(MDP)的相互作用本章考察PHT2在MDP诱导的NOD2依赖的免疫应答中的作用。我们将RAW264.7巨噬细胞瞬时转染pcDNA3.1(+)-musPHT2-his质粒,过表达PHT2蛋白。给予上述细胞和对照组细胞MDP或LPS刺激,分别从mRNA水平和蛋白水平考察促炎因子IL-6、TNFα和IL-1β的表达,结果显示,过表达PHT2蛋白能够显著上调MDP诱导的促炎因子表达,但不影响LPS诱导的促炎因子表达,提示PHT2极可能是通过其转运功能加剧MDP诱导的炎症反应。我们还考察了 MDP对PHT2的调控作用,RAW264.7巨噬细胞给予不同浓度的MDP刺激以及不同时间的MDP刺激,PHT2的表达均显著上调,但未发现PHT1表达变化。上述结果说明,PHT2具有促进炎症发展的作用,且该作用极有可能是通过转运细菌肽而实现。综上所述,本研究阐明了 LPS诱导的急性炎症和溃疡性结肠炎对PHT2的表达调控及相关机制,证明了 PHT2可通过转运细菌肽促进炎症的发生发展,为炎症相关疾病的发病机制和治疗提供了新的思路。