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目的:急性胰腺炎是由多种病因引发的胰腺急性炎症性疾病,在该病的病程中广泛存在着组织炎症和细胞坏死等现象,而胰腺组织炎症和坏死的程度与急性胰腺炎的严重程度和预后有着直接的关系。我们的研究目的为探讨胰腺腺泡细胞氧化应激的程度和细胞自噬及程序性坏死的关系,旨在更多的了解细胞层面上胰腺细胞炎症和坏死的关系。方法:选取大鼠胰腺腺泡细胞系AR42J作为工具,在普通细胞培养箱内以DMEM+10%FBS培养3-4个周期。使用20%精氨酸溶液干预AR42J细胞,以CCK8测定细胞相对活性的方法制作出精氨酸干预AR42J的药-时曲线和药-效曲线,测定后续实验适宜的干预浓度和时间。获知精氨酸干预浓度和时间后,即将精氨酸干预的AR42J细胞作为阳性对照,将无精氨酸干预的AR42J作为阴性对照,而后分别用Nec-1、MLT、Wortmannin干预AR42J细胞。即实验分组为五组:空白对照组(CON组)、精氨酸干预组(Arg组)、Nec-1+精氨酸干预组(Nec-1组)、MLT+精氨酸干预组(MLT组)、Wortmannin+精氨酸干预组(Wort组)。而后使用碘-淀粉比色法测定被地塞米松诱导的AR42J在干预前后胰淀粉酶活性的变化。使用免疫荧光法标记细胞爬片中的LC3、TNF-α、AKT、PI3K蛋白。使用AnnexinV-PI染色流式细胞术测定细胞凋亡和坏死。使用JC-1荧光标记测定线粒体膜电位。使用DCF荧光标记探针测定ROS浓度。结果:精氨酸干预AR42J细胞在受干预24h后,精氨酸的ic50为27.8mg/ml,在细胞受干预48h后,精氨酸的ic50为4.3mg/ml。,根据药-时曲线和药-效曲线,取精氨酸干预浓度为5mg/ml和10mg/ml,干预时间为24h和48h。相较于阴性对照组,精氨酸干预AR42J细胞48h后,Arg组细胞AMY活性明显下降。免疫荧光爬片可见LC3在干预后24小时时荧光强度上升(p<0.05),形态呈明显聚集状。AnnexinV-PI染色流式细胞术显示Arg组细胞晚期凋亡及坏死比例明显升高(p<0.05)。Nec-1组使用溶于DEPC的50mM Nec-1和前述浓度精氨酸干预AR42J细胞。干预48h后Nec-1组细胞AMY活性明显下降。免疫荧光显示该组细胞TNF-α荧光强度上升,LC3于干预后24h时荧光强度高,干预后48h荧光强度较低。AnnexinV-PI染色流式细胞术显示Nec-1组细胞晚期凋亡和坏死的比例明显下降(p<0.05),但相较于CON组凋亡比例仍高(p<0.05)。JC-1探针显示相较于Arg组,Nce-1干预后线粒体膜电位少量回升(p<0.05),相较于CON组线粒体膜电位仍较低。DCFH-DA荧光探针显示该组ROS浓度未见明显下降。MLT组使用溶于无水乙醇的0.5nM MLT和前述浓度精氨酸干预AR42J细胞48H。免疫荧光显示该组细胞TNF-α荧光强度上升,LC3荧光强度高。AnnexinV-PI染色流式细胞术显示,相较于Arg组和CON组,MLT组细胞晚期凋亡和坏死的比例上升(p<0.05),凋亡细胞占细胞总数比例上升(p<0.05)。JC-1探针显示相较于Arg组,MLT干预后线粒体膜电位回升(p<0.05),相较于CON组线粒体膜电位仍较低。DCF荧光探针显示细胞内ROS浓度明显下降(p<0.05)。Wort组使用溶于DEPC的100nM Wortmannin和前述浓度精氨酸干预AR42J细胞48H。免疫荧光显示该组细胞TNF-α荧光强度上升,LC3荧光强度于干预后48h仍高,p-Akt荧光强度相较于CON组升高,但相较于Arg组较低,PI3K相较于CON组高,相较于Arg组无明显变化。AnnexinV-PI染色流式细胞术显示,相较于Arg组,Wort组晚期凋亡和坏死下降(p<0.05),相较于CON组,Wort组细胞凋亡比例较高(p<0.05)。JC-1探针显示相较于Arg组,Wortmannin干预后线粒体膜电位无明显变化(p>0.05),相较于CON组线粒体膜电位较低。DCF荧光探针显示细胞内ROS浓度未明显下降(p>0.05)。结论:1)使用Arginine干预AR42J细胞可产生细胞损伤和AMY活性下降,可作为急性胰腺炎体外模型使用。2)使用Nec-1抑制细胞程序性坏死可减轻Arginine干预造成的细胞损伤,减少细胞晚期凋亡和坏死的比例。3)使用MLT减少细胞内氧自由基浓度,可明显减轻细胞氧化应激程度,但不能减少细胞的凋亡和坏死,同时使得细胞晚期凋亡和坏死的比例增加。4)使用Wortmannin抑制细胞自噬体的形成,可使LC3降解时间延长,但不能明显减少细胞的凋亡和坏死,但细胞晚期凋亡和坏死比例减少,细胞更多呈现早期凋亡。