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果皮色泽是重要的果实外观品质之一,红梨色泽的形成主要源于果皮中花青苷的积累。目前通过经典遗传学手段对花青苷合成的调控机制已经有了比较深入的研究,但DNA甲基化和microRNA(miRNA)对红梨果皮着色的调控研究较少。本研究以绿皮梨’早酥’及其红色芽变’早酥红,(现已正式命名为’红早酥’),红色砂梨品种’满天红’和’美人酥’,红色西洋梨品种’凯斯凯德’为主要试材,探讨了 DNA甲基化和miRNA对红梨着色调控的相关机制,同时筛选了光敏感型红梨材料,主要研究成果如下:1、’早酥红’各组织的花青苷含量显著高于’早酥’,且’早酥红’条纹着色成熟果中红条纹的花青苷含量高于绿条纹。基因表达结果显示,PpPAL1、PpPAL2、PpCHS1、PpCHS2、PpCHT1、PpCHI2、PpCHI3、PpF3H、PpDFR1和PpANS等基因的表达量在幼嫩组织里面要显著高于成熟组织,而PpUFGT2和PpMY210的表达则与花青苷的积累呈现显著的正相关,但是不同材料上PpUFGT2和PpMYB10基因编码区和启动子区域均未产生序列变异。对不同材料上PpMYB10基因启动子区域的甲基化水平进行分析发现,红色材料上的甲基化水平要显著低于绿色材料。因此我们推测,MYB10启动子区域的去甲基化与’早酥’梨红色芽变’早酥红’及’早酥红’红色条纹果皮的花青苷积累有关。2、红色砂梨品种’满天红’和红色西洋梨品种’凯斯凯德’对采前套袋和采后紫外光/可见光诱导处理同样具有不同的响应模式。去袋10天后和采后紫外光/可见光处理10天后,砂梨品种’满天红’可以积累较多的花青苷,而西洋梨品种’凯斯凯德’几乎没有着色。PAL和DFR的酶活性在’满天红’着色过程中升高。基因表达结果显示,PpCHS3、PpCHI3、PpUFGT1和PpMYB10等4个基因的转录在套袋和采后紫外光/可见光处理过程中与花青苷的积累呈显著正相关,说明这4个基因可能是梨上调控花青苷合成的关键基因。3、去袋后,’美人酥’果皮花青苷逐渐积累,花青苷合成相关结构基因和转录因子基因表达上调。通过sRNA和降解组测序,发现在梨果皮中表达的27个miR156家族成员,并发现4个可以被miR156降解的SPL基因。通过梨全基因组SPL家族成员鉴定,发现19个PpSPL成员,其中11个成员拥有miR156的剪切位点。在’美人酥’果皮着色过程中,miR156表达上调,而PpSPL基因中,PpSPL2、PpSPL5、PpSPL7、PpSPL9、PpSPL1O、PpSPL13、PpSPL16、PpSPL17和PpSPL18的表达下调。酵母双杂结果显示,梨上调控花青苷合成的3类转录因子可以形成MYB/bHLH/WD40转录因子复合体,并且PpSPL10和PpSPL13与PpMYB10存在互作。结合前人的研究结果和本试验的数据,我们提出了以下假说:黑暗中,由于miR156的低表达,高表达的SPL通过破坏MYB/bHLH/WD40蛋白复合体的形成,进而抑制CHS、AN和UFGT的表达来负调控花青苷的合成。去袋进行重曝光后,miR156上调表达并降解SPL基因,使得MYB/bHLH/WD40蛋白复合体重新形成,从而促进了花青苷合成相关结构基因的表达,并最终诱导花青苷的合成。