论文部分内容阅读
研究目的： 本研究旨在利用基因芯片技术，探讨长链非编码RNAs（long non-coding RNA,lncRNA）在卵巢子宫内膜异位症在位内膜表达情况，构建卵巢内异症lncRNAs表达谱，筛选出其特异性lncRNAs。同时利用生物信息学分析预测异常表达lncRNAs潜在生物学功能。并采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）法检测特定lncRNAs在组织及细胞水平表达情况，为进一步探索卵巢子宫内膜异位症发生发展中可能的分子机制奠定基础。 研究方法： 1.经东南大学附属中大医院伦理学委员会同意（批件号：2017ZDSYLL034-P01），收集东南大学附属中大医院卵巢子宫内膜异位症患者在位内膜标本和子宫肌瘤患者正常子宫内膜标本进行本实验研究。所有标本均经病理确诊。 2.利用Array v4,4x180K人类lncRNA芯片检测3例卵巢子宫内膜异位症患者在位内膜与3例对照内膜组织中lncRNAs和mRNAs的表达情况，建立卵巢子宫内膜异位症相关lncRNAs及mRNAs差异表达谱。 3.随机挑选6条异常表达的lncRNAs（3条表达上调和3条表达下调），在12例卵巢子宫内膜异位症患者在位内膜与12例对照内膜组织中进行qRT-PCR检测，对基因芯片结果进行验证。 4.生物信息学分析探讨差异表达lncRNAs可能参与的生物学功能，具体包括：①差异表达mRNAs行Kycrto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway分析和Gene Ontology（GO）分析；②lncRNA-mRNA共表达分析；③lncRNAs靶基因预测。 5.根据生物信息学分析结果，筛选出3条异常表达且具有潜在生物学意义的lncRNAs，利用qRT-PCR法检测其在组织和细胞水平的表达情况。 研究结果： 1.芯片结果显示，卵巢子宫内膜异位症在位内膜与对照内膜相比存在845个差异表达的lncRNAs和1793个差异表达的mRNAs。在差异表达的lncRNAs中有312个表达上调和533个表达下调。其中上调最明显的lncRNA为RP11-262H14.3（差异倍数为15.166），下调最明显的lncRNA为CTB-178M22.2（差异倍数为26.482）。在差异表达的mRNAs中，上调的mRNAs总数为1433个，下调的mRNAs总数360个。其中SEMA3E上调最明显（差异倍数为25.013），下调最明显的mRNA为STEAP4（差异倍数为32.799）。 2.qRT-PCR结果显示ENSG00000270346.1、ENSG00000259327.1和ENSG00000231312.2在卵巢子宫内膜异位症在位内膜组织中表达上调，而XLOC_011334、ENSG00000204054.7和ENSG00000271738.1则表达下调，与芯片检测结果一致。 3.生物信息学分析 ①对差异表达mRNAs进行GO分析，发现差异mRNAs在代谢、细胞过程、调控、定位等生物学过程明显富集；在细胞组成方面可定位于细胞外、细胞膜、胞浆、胞核等各个方面；在结合、蛋白结合、催化活性、离子结合等分子功能明显富集。 ②Pathways分析显示，表达上调的mRNAs共参与87项显著性信号转导通路，包括代谢信号通路、肿瘤相关通路、磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3-ki-nase/proteinkinase B,PI3K/AKT）信号通路、粘着斑等；表达下调的mRNAs共参与38项显著性信号转导通路，包括酪氨酸代谢、Ras信号通路、补体和凝血级联反应、肿瘤坏死因子信号通路等。 ③lncRNA-mRNA共表达分析结果显示，共有483对lncRNA-mRNA存在共表达关系，其中253对为正相关，230对为负相关。lncRNA ENST00000538219.1-mRNA CYCS具有最高的负相关系数。lncRNA ENST00000558838.1-mRNA PCSK6具有最高的正相关系数。 ④对差异表达的lncRNAs靶基因进行GO分析和Pathway分析，结果显示这些靶基因主要富集的生物学过程涉及到代谢、信号传导、调控、免疫、刺激反应、细胞应答等；细胞组分方面可定位于细胞外基质、细胞器、细胞连接和膜等各个方面；分子功能涉及催化活性、酶调节活性、结合、抗氧化活性等。主要富集的信号通路为粘蛋白型O-聚糖的生物合成、甲状腺激素信号通路、代谢信号通路、肿瘤相关通路、p53信号通路、mTOR信号通路、VEGF信号通路等。 4.筛选出的3条具有潜在生物学意义的lncRNAs(RP11-363G2.4、RP11-548O1.3和WAC-AS1)在卵巢内异症在位内膜组织及在位内膜间质细胞中均高表达，三者参与到多个内异症相关的生物学过程和信号转导通路的调节。 研究结论： 1.基因芯片检测成功构建了卵巢子宫内膜异位症相关lncRNAs差异表达谱，筛选出卵巢内异症在位内膜组织中大量异常表达的lncRNAs，这些lncRNAs可能通过参与调控卵巢内异症发生发展中的多种信号转导通路和生物学过程在卵巢子宫内膜异位症发病过程中发挥着重要作用。 2.RP11-363G2.4、RP11-548O1.3和WAC-AS1表达失调可能参与卵巢子宫内膜异位症的发生、发展，这三种lncRNAs具有进一步研究其在内异症中功能及相关机制的价值。