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胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1,GLP-1)是一种由胰高血糖素原基因经过差异化处理所得的肠促胰岛素,以葡萄糖依赖的方式增加胰岛素分泌。肠促胰岛素是胃肠道响应营养素而产生的激素,是维持葡萄糖稳态所必需的。GLP-1以GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)酰胺两种循环等效分子形式存在,其中GLP-1(7-36)酰胺在循环中更丰富。GLP-1(7-36)酰胺在分泌后快速地被酶降解,生成GLP-1(9-36)酰胺和GLP-1(28-36)酰胺。GLP-1(28-36)酰胺广泛分布于心肌细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞和肾上皮细胞。GLP-1(28-36)酰胺在改善肝脏代谢,保护β细胞,改善葡萄糖处理,抑制体重增加,甚至在直接保护心脏等方面发挥着的作用。已有研究证明GLP1(28-36)酰胺具有涉及Wnt和线粒体介导的信号传导途径的抗糖尿病作用。目前,枯草芽孢杆菌芽孢是研究最全面的表面展示系统,其表面的多种衣壳蛋白可作为异源蛋白的载体蛋白。而且芽孢在低pH的胃酸环境中依然能保持活力,有着作为口服药物递送载体的潜力。因此,本研究选用枯草芽孢杆菌芽孢作为递送载体,并根据人的肠道环境,设计带有肠激酶位点的串联的5个GLP-1(28-36)(5*GLP-1(28-36))展示于芽孢表面,然后利用Ⅱ型糖尿病模型小鼠来验证重组孢子在治疗糖尿病方面的功效。本研究的主要内容和结果如下:⑴含有肠激酶位点的重组质粒pJS700-GLP-1(28-36)的构建将合成的带有肠激酶位点的5*GLP-1(28-36)连接到质粒pJS700上,使5*GLP-1(28-36)与芽孢衣壳蛋白基因cotC融合,构建含有融合cotC-glp-1(28-36)基因的重组质粒pJS700-GLP-1(28-36)。⑵在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示5*GLP-1(28-36)用质粒pJS700-GLP-1(28-36)转化枯草芽孢杆菌感受态细胞,利用红霉素筛选得到重组菌株,然后诱导重组菌株产生芽孢,通过免疫印迹法和免疫荧光法验证发现5*GLP-1(28-36)在枯草芽孢杆菌芽孢表面成功的表达。⑶Ⅱ型糖尿病小鼠模型的构建高脂高糖饲料饲喂联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ),构建Ⅱ型糖尿病模型小鼠,期间监测小鼠体重及空腹血糖浓度。结果显示,在饲喂高脂高糖饲料4周后,模型组小鼠的体重显著高于正常组小鼠(P<0.01);在开始注射STZ 3周后,模型组小鼠的体重显著低于正常组小鼠(P<0.01)。从开始饲喂高脂高糖饲料到造模成功,模型组小鼠的平均空腹血糖由7mM升至24mM。⑷小鼠口服重组芽孢的功能分析给糖尿病模型小鼠连续口服重组芽孢13周后检测重组芽孢功效。结果显示实验组的平均空腹血糖水平从24mM下降至17mM,相较于对照组显著降低(P<0.05);在注射丙酮酸盐30min后,实验组的血糖显著低于对照组的血糖(P<0.01),证明重组芽孢降低了小鼠的糖异生水平;在腹腔注射葡萄糖30min后和120min后,实验组的血糖均显著低于对照组的血糖(P<0.01),证明重组芽孢提高了小鼠对血糖的调控能力;通过稳态模型计算胰岛素敏感指数,显示重组芽孢提高了小鼠的胰岛素敏感性;通过病理观察结果发现重组芽孢对小鼠的肝脏和胰岛也有一定的保护作用,并且实验组的胰脏中GLP-1(28-36)的含量有所升高。⑸GLP-1(28-36)的体外鉴定实验将合成的带有FITC的GLP-1(28-36)九肽添加到结肠癌细胞中,静置1h后观察到GLP-1(28-36)进入到结肠癌细胞,说明在重组孢子进入肠道后,其表面展示的5*GLP-1(28-36)可能经肠激酶切割,能够进入结肠细胞发挥作用。