莲雾果实木质素合成相关MYB转录因子基因的克隆及分析

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莲雾(Syzygium samarangenese[Blume]Merrill&L.M.Perry)果实色泽艳丽,营养丰富,风味独特。但果实皮薄、组织疏松,采收后果实中心的絮状绵软逐渐向外部扩展,严重影响口感和风味。探究转录因子在莲雾果实木质素代谢中的作用,有助了解采后莲雾果实絮状绵软劣变的调控机理,但目前相关研究报道较少。本研究以台湾“蜜风铃”莲雾果实为材料,研究了NO处理对采后莲雾果实生理品质及木质素合成的影响,从莲雾转录组数据库筛选得到20个NO处理后差异表达的木质素合成相关MYB转录因子,进行生物信息学分析,选择在莲雾果实贮藏期间表达差异最大的SsMYB1基因进行克隆和亚细胞定位分析。以阐释MYB转录因子对采后莲雾果实木质素代谢的影响。主要研究结果如下:1.采用10μL/L(处理组)NO熏蒸和0μL/L(对照组)处理采后莲雾果实,结果显示:在采后莲雾果实贮藏期间(0-12 d),失重率和絮状绵软指数不断上升,果肉硬度逐渐下降,可溶性固形物含量和总糖含量呈现先增长后下降的趋势;木质素含量及木质素合成关键酶PAL、C4H、4CL、CAD和POD的活性呈上升趋势。与对照组相比,NO处理组减缓了果实失重率的增加、絮状绵软组织的扩大、果实硬度的下降、可溶性固形物及总糖含量的降低,抑制了木质素合成及关键酶活性的上升,从而延缓了果实木质化,维持较好的果实品质。2.从课题组前期建立的莲雾转录组数据库中筛选得到20个与木质素合成相关的MYB转录因子。根据物种同源性比对结果对SsMYBs家族成员进行命名,分别为:SsMYB1、SsMYB3、SsMYB4、SsMYB5、SsMYB6、SsMYB10、SsMYB20、SsMYB33、SsMYB39、SsMYB44、SsMYB48、SsMYB54、SsMYB77、SsMYB86、SsMYB108、SsMYB114、SsMYB306、SsMYB308、SsMYB330和SsMYBC1。对这20个MYB转录因子进行生物信息学分析。结果表明,20个莲雾木质素合成相关MYB蛋白由91-591个氨基酸组成,对应蛋白质的相对分子质量为9.98-64.91 k D,理论等电点(p I)为4.92-9.73,多为不稳定亲水性蛋白,无信号肽,亚细胞定位于细胞核上,无明显跨膜结构域,不属于分泌蛋白。经系统发育树分析,莲雾与番樱桃、巨桉、玫瑰木的亲缘性较高。表达分析结果表明,SsMYB1、SsMYB4、SsMYB20、SsMYB54、SsMYB77、SsMYB108、SsMYB114和SsMYB308在贮藏期间表达量总体呈上升趋势,NO处理减缓了该上升趋势,推测这些转录因子可能为转录激活子,促进木质素的合成;而SsMYB3、SsMYB5、SsMYB6、SsMYB10、SsMYB33、SsMYB39、SsMYB44、SsMYB48、SsMYB86、SsMYB306、SsMYB330和SsMYBC1在贮藏期间表达量不断下降,NO处理抑制了该下降趋势,推测它们可能为转录抑制子,延缓木质素的合成。此结果进一步说明所挑选的20个莲雾MYB转录因子对莲雾果实采后木质素合成起着调控作用。3.选择贮藏期间表达差异最为明显的SsMYB1基因进行克隆,其序列全长为1230 bp,并对SsMYB1基因进行亚细胞定位验证。通过融合基因定位法将植物表达载体p CAMBIA1301-35SN与绿色荧光蛋白(GFP)进行融合表达。构建重组表达质粒SsMYB1-EGFP-p CAMBIA1301-35SN,用农杆菌侵染法进行亚细胞定位,通过荧光显微镜观察重组质粒在洋葱表皮细胞中的分布以确定SsMYB1基因在细胞中的定位表达。研究结果表明,SsMYB1基因的重组表达载体定位在细胞核上,说明SsMYB1蛋白属于细胞核蛋白。
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