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高效可行的组织培养体系是植物转基因研究和应用的前提条件,科研工作者在优化小麦组织培养体系方面做了大量的研究,小麦组织培养取得了一定的进展,然而,至今小麦组织培养效率依然很低,严重制约了小麦遗传转化研究的进程。小麦胚性愈伤组织形成的分子机制和参与的生物学途径尚不清楚。因此,研究小麦胚性愈伤组织形成的分子机制、建立高效的小麦组织培养体系至关重要。研究表明miRNAs在植物生长发育、逆境胁迫、细胞分化和胚胎形成中起重要调控作用。高通量测序技术在转录组测序和小RNA测序方面的应用和生物信息学的发展,为研究小麦胚性愈伤组织形成的相关基因和分子调控机制提供了条件。本研究筛选了小麦胚培养条件,以幼胚产生的胚性愈伤组织和成熟胚产生的非胚性愈伤组织为材料,在胚性愈伤组织形成的三个重要时期分别取样,构建转录组测序文库和小RNA测序文库,利用HiSeq2000测序平台进行测序,筛选了两种类型的愈伤组织之间、同种愈伤组织不同培养时间之间的表达差异基因和表达差异miRNA,分析了差异表达基因和差异表达miRNA(靶基因)的功能、参与调控途径,筛选了胚性愈伤组织形成相关基因和相关microRNA,主要结果如下:1.在供试的小麦品种中,以周麦18幼胚的胚性愈伤组织诱导率最高,为76.83%,其次是豫麦202,为54.17%,豫农201次之,为49.18%。而分化率方面,豫农201分化效率较高,花后14d为81.15%。周麦18和豫农202次之,分别为78.08%和46.03%。综合愈伤组织诱导率和分化率,以花后14d周麦18幼胚培养效果最好,其次是花后14d豫农201和豫农202。从幼胚胚龄和组培的关系看,花后10-12d幼胚胚性愈伤组织诱导率低,但分化率高,花后18天幼胚,愈伤组织诱导率高和分化率都降低,以豫农201为例,10d胚龄胚性愈伤组织诱导率和分化率分别是21.53%和92.06%,12-16d的幼胚胚培养操作容易,诱导能力和分化能力都较理想,而花后18d及以后,愈伤组织诱导和分化能力减弱。总之适宜的培养时间是花后12-16d,以花后14d为最适胚龄。2.相同品种幼胚和成熟胚胚性愈伤组织诱导率和发育表型差异明显,在15d的体外培养过程中,幼胚能够形成胚性愈伤组织,而成熟胚却需要继代培养才能形成胚性愈伤组织。来源于幼胚的胚性愈伤组织可直接分化成簇状不定芽,来源于成熟胚的胚性愈伤组织分化培养容易产生不定根。3.小麦幼胚、成熟胚在培养3d、6d和15d时取样,提取RNA构建6个转录组测序文库,利用HiSeq2000测序平台进行测序,生物信息学分析结果表明,从6个文库中共获得155,192,839 条高质量 paired-end reads,经 de novo 组装获得 331,201 条平均长度为 1009.69 bp的transcripts和142221条平均长度为657 bp的Unigenes。这些Unigenes通过与NCBI蛋白数据blastx比对,142221条Unigenes中共有59,976条(42.17%)获得注释。其中58,723条(41.29%)Unigenes 比对到 NCBI non-redundant protein(Nr)数据库、29,587 条(20.80%)比对到Pfam数据库、26,529条(18.65%)比对到在Swiss-Prot数据库、34,761条(24.44%)Unigenes被注释到GO分类和11,513条(8.10%)Unigenes被注释到25个COG分类中。4.对幼胚和成熟胚愈伤组织文库在相同培养时间进行基因表达水平比对分析,结果在培养3d、6d和15d三个时期分别有3181、2085和1468条Unigenes差异表达(log2Ratio(IME/ME)>1或<-1,P<0.01),上调表达Unigenes数分别是1,972、787 和631,随着愈伤组织发育,比对中差异表达Unigenes数减少。差异表达Unigenes的功能分析表明,一些差异表达转录因子、生长素相关基因及响应胁迫相关基因可能参与小麦胚性愈伤组织形成。5.小麦幼胚、成熟胚在培养3d、6d和15d时取样,构建6个小RNA测序文库,利用HiSeq2000测序平台进行测序,在6个文库中产生1678-2435万原始reads,过滤掉接头和小于18nt和大于30nt及低质量序列,每个文库产生750-1311万clean reads及153-635万聚类reads。在小RNA文库中共鉴定到85个已知miRNAs,包括65个有小麦参考基因组的已知miRNAs和13个来源于其他物种这里第一次在小麦中鉴定到的已知miRNAs。鉴定到171个新型miRNAs和41个候选miRNAs。在培养3d、6d和15d三个时期,幼胚和成熟胚在相同培养时间比对,分别有30、33和18个已知miRNAs差异表达(fold change>2或<0.5,P<0.05),69、67和37个新型miRNAs差异表达。6.qRT-PCR荧光定量验证了一部分miRNAs和靶基因的表达水平,大部分miRNAs的表达水平和高通量测序结果保持一致。荧光定量验证靶基因结果表明,靶基因表达水平和其对应miRNA的测序表达水平呈负相关。我们进一步利用5’ RACE试验验证靶基因的剪切位点,结果表明我们预测的miRNA靶基因是可靠的。通过对差异表达miRNA靶基因功能分析表明,这些靶基因的生物学功能涉及响应胁迫、新陈代谢、信号转导等功能,一些差异表达miRNA靶基因在分子功能、生物过程方面具有和胚性愈伤形成相关的功能,如miR156、miR164和miR1432等,这些miRNA可能通过调节其靶基因参与小麦胚性愈伤组织的形成。