[目的] 在机体的免疫应答过程中，B7-H4作为重要的共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的共刺激信号。活化的T细胞产生以IL-10、IL-2、IL-12、FNF-α、γ-干扰素(IFN-γ)为主的细胞因子介导对肝细胞的免疫性损伤成为病毒性肝炎的主要致病机理。研究人员发现B7-H4分子在自身免疫性疾病中对T细胞的活化发挥着一定的负性调控作用，它能抑制CD4+T细胞的活化、增殖，阻止细胞周期在G0/G1期。但是，B7-H4分子对T细胞免疫应答进行的精细调节机制还有待进一步阐明。 本文采用Con A诱导性肝损伤小鼠模型进行可溶性mB7-H4蛋白干预实验，以探讨可溶性mB7-H4蛋白是否对肝脏的免疫性损伤具有保护作用及其作用机制。 本研究将流体动力法(Hydrodynamies-based procedure)应用于小鼠可溶性mB7-H4蛋白的体内表达，成功地将pcDNA3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏，获得了重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达。通过可溶性mB7-H4蛋白对Con A致肝脏免疫性损伤的干预实验初步表明，可溶性mB7-H4蛋白对Con A导致的T细胞介导的肝脏免疫性损伤具有保护作用。这一发现为可溶性mB7-H4蛋白在病毒性肝炎临床防治方面的研究提供了重要的理论依据。 [方法] 1.可溶性mB7-H4蛋白的表达与纯化 (1)将构建好的原核表达质粒pET/mB7-H4，转化到E.coli DH5 α进行保种，转化到E.coli BL21(DE3)，进行可溶性蛋白mB7-H4的表达。 (2)经IPTG诱导，进行时间和温度的定位，确定最佳表达时间，最佳表达温度和最佳IPTG浓度。 (3)采用Ni-NTA亲和层析方法，在变性条件下，给予大量表达mB7-H4蛋白以纯化。然后，通过尿素梯度复性方法，获得大量可溶性mB7-H4蛋白。 (4)复性后的可溶性mB7-H4蛋白，经去除内毒素处理，用于Con A诱导小鼠肝损伤的治疗。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达 (1)采用即时RT-PCR的方法，定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内的表达。 (2)建立可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg的ELISA检测方法，定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达。 3.可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导小鼠肝损伤的保护作用 (1)检测血清ALT和AST，观察分析可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导小鼠肝损伤的保护作用。 (2)肝组织病理切片，判断可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导小鼠肝损伤的保护作用。 (3)检测血清IL-4和IFN-γ，观察分析可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导小鼠肝损伤的保护作用。 [结果] 1.可溶性蛋白mB7-H4的表达与纯化pET/mB7-H4导入E.coli BL21(DE3)后，经IPTG诱导产生包涵体mB7-H4蛋白。包涵体经过洗涤、复性、透析、亲和层析和去除内毒素后，获得可溶性mB7-H4蛋白，纯度在90％以上。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达 (1)即时定量RT-PCR结果表明，pmB7-H4-Fc经小鼠尾静脉注射，能够稳定地表达，量在48小时达到最高。 (2)采用ELIsA技术，定量检测小鼠可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg,结果表明，经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc，能在肝组织中稳定表达，48小时分泌的量达到最高值，即120ng/ml。 3.可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导小鼠肝损伤的保护作用 (1)小鼠血清ALI和AST 在注射Con A后，各组小鼠血清ALT和AST水平较正常水平均有明显升高，达注射前的3～5倍。表达载体组和蛋白组ALT和AST值均明显低于阳性对照组和/或空载体组。表达载体组与阳性对照组间血清ALT和AST浓度，经方差分析：①Falt=9668，p=0.004；Fast=12.368，p=0.002(质粒组)；②Falt=12.394，p=0.001；Fast=6.422，p=0.016(蛋白组)。表达载体组与阳性对照组间血清ALT和AST浓度比较，具有显著性差异。结果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A诱导小鼠肝损伤中能减轻Con A带来的损伤，具有保护作用。 (2)肝组织病理切片在注射Con A后，Con A组和空载体组肝细胞即出现变性改变，肝细胞肿胀、胞浆疏松、细胞结构不完整、肝窦内红细胞淤积，门静脉区和中央静脉区可见大量淋巴细胞、多叶核粒细胞浸润，胞核破损，胞浆出现囊性或空泡样改变。相比之下，表达载体组以及蛋白组的小鼠在注射Con A后，其肝脏的损伤比较轻，汇管区可见少量淋巴细胞浸润，有些细胞胞浆出现了空泡样改变，但胞核完整，肝脏内未见坏死区。结果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A诱导小鼠肝损伤中，能减轻Con A带来的损伤，具有保护作用。 (3)小鼠血清IL-4和IFN-γ在注射Con A后，各组小鼠血清IL-4和IFN-γ水平较正常水平均有明显升高，达正常值的5～10倍。表达载体组和蛋白组IL-4和IFN-γ值明显低于阳性对照组和/或空载体组。表达载体组与阳性对照组间血清IFN-γ浓度，经方差分析：①Falt=13.728，p=0.001；Fast=22.250，p<0.0001(质粒组)；②Falt=20.6456，p<0.0001；Fast=10.573，p=0.002(蛋白组)。表达载体组与阳性对照组间血清IL-4和IFN-γ浓度比较，具有显著性差异。结果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A诱导小鼠肝损伤中能减轻Con A带来的损伤，具有保护作用。 [结论] 初步证实了可溶性mB7-H4蛋白对Con A诱导的肝脏免疫性损伤具有保护作用。可溶性mB7-H4蛋白可能是通过抑制IL-4和IFN-γ的产生和/或分泌而发挥对肝脏保护的作用。