选题依据:抑郁症又称抑郁障碍,是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的精神性疾病,预计到2020年将成为第二大疾病负担源。因其发病机制复杂,西药治疗副反应较大等特点,国内外许多学者将越来越多的研究转向中医药领域。其中,以“疏肝解郁”的名方逍遥散为主的研究最为热门。本课题组前期对复方逍遥散的研究中发现,君药柴胡中所含的多炔类成分容易入血,能透过血脑屏障且药代动力学参数适宜。进而从柴胡药材的低极性成分提取分离得到多炔化合物,经体外单胺递质再摄取抑制活性测试中均表现出较强的抑制活性,有的甚至超过阳性对照药。这类化合物结构相似,推测具有推相似活性,但其无法量产,且不能完全代表低极性成分,因此仍采用柴胡石油醚部位进行抗抑郁作用量-效/毒的辩证关系研究,发现柴胡石油醚部位具有很好的抗抑郁活性。但是其发挥抗抑郁作用的最佳剂量尚不能确定,作用机制也不明确,故需要进行深入的研究。目的:研究柴胡石油醚部位抗抑郁的作用机制,结合经典的神经递质与HPA轴相关指标测定,利用转录组学技术和实时荧光定量PCR技术对其机制进行研究探讨,为以后更好的利用柴胡提供依据,为抗抑郁新药的研发提供参考。方法:1、经过对前期方媛论文中行为学指标的分析,选择具有代表性的实验组进行深入研究:模型及给予模型不同剂量柴胡石油醚部位提取物组(CM,C4、C5、C6、C7),正常及给予正常不同剂量柴胡石油醚部位提取物组(ZK,Z4、Z5、Z6、Z7),阳性药组(CY)。试验中统计为:D0(CM、ZK),DY(CY),D4(C4、Z4)、D5(C5、Z5)、D6(C6、Z6)、D7(C7、Z7)剂量组。建立8种神经递质(5-HT、GABA、Glu、ACH、NE、DA、5-HIAA和HVA)UHPLC-MS/MS定量分析方法,并用于血清及海马组织样品的测定;采用ELISA法对血清HPA轴指标进行检测。通过对以上各组大鼠血清及海马组织中8种神经递质的含量以及血清中CRH、ACTH、CORT的水平检测,研究柴胡石油醚部位抗抑郁活性机制,并结合前期工作基础筛选出柴胡石油醚部位抗抑郁最佳剂量。2、利用Illumina高通量测序技术对CUMS模型组(CM)、空白组(ZK)、给予模型大鼠/正常大鼠柴胡石油醚部位D6(C6、Z6)剂量组进行转录组分析。基于各样本转录组基因表达量,对不同组别样本分别进行比较,统计分析造模与否、给药与否显著差异表达基因。对各样本间显著差异表达基因进行GO、KEGG分析,探讨造模与给药分别参与的主要生物学功能和生物学通路。另外,对正常给药的相关调节进行了并列考察,以期探明药物作用辩证关系。最后对关键基因进行筛选。3、利用qPCR技术,对利用转录组学筛选出的与抑郁和柴胡石油醚部位抗抑郁有关的32种基因的表达水平进行分析。结果:1、血清中神经递质测定结果显示:与空白组相比,CUMS模型组中5-HT和NE的含量显著降低;5-HIAA和GABA的含量显著升高。柴胡石油醚部位对血清中由CUMS造模引起的5-HT、NE、5-HIAA和GABA的显著变化有不同程度的回调,当剂量为C6或C7时,回调程度接近空白组,且Z6和Z7与正常比较无明显差异;海马组织中神经递质测定结果显示:与空白组相比,CUMS模型组中5-HT、DA和Ach的含量均有显著降低;模型组中Glu含量显著升高。柴胡石油醚部位对海马组织中由CUMS造模引起的5-HT、Glu和Ach的显著变化有不同程度的回调,且C6剂量组的回调作用较明显,且Z6与正常组比较无明显差异;血清中HPA轴指标测定结果显示:与空白组相比,CUMS模型大鼠血清中ACTH含量显著升高,而CRH和CORT并无显著差异,但是CORT有升高趋势。对血清中由CUMS造模引起的ACTH的显著升高和CORT的升高有不同程度的回调。2、通过高通量转录组测序技术成功构建了大鼠肝组织的转录组,分析各样本间显著差异表达基因,并对各对样本间显著差异表达基因进行GO、KEGG分析,探讨了其参与的主要生物学功能和生物学通路。CUMS模型的基因变化与昼夜节律通路、p53信号通路、类固醇激素的合成通路、视黄醇代谢通路、甘氨酸代谢通路等相关。柴胡石油醚部位抗抑郁作用可能是通过调节胆汁分泌与合成通路、类固醇激素的合成通路、细胞色素P450的异物代谢通路、药物代谢通路、视黄醇代谢通路等发挥抗抑郁活性;而对正常大鼠给药后,则可能调节类固醇激素的合成通路、视黄醇代谢通路、药物代谢通路、昼夜节律通路、p53信号通路等。最后根据差异表达基因和KEGG通路分析结果筛选出与昼夜节律、5-羟色胺能神经突触、胆汁分泌与合成、代谢相关和其他通路相关的32条基因进行进一步验证和研究。3、采用qPCR法对大鼠肝组织中32条基因的表达水平进行分析。CUMS造模能引起体内昼夜节律相关的生物钟基因Npas2、Cry1、Arntl、Rora和Rorc的过度表达,以及Bhlhe41、Nr1d1、Per1、Per2和Per3表达的显著降低;能引起参与胆汁分泌与合成的基因Cyp7b1和Kcnn2的过度表达,及Nceh1表达的显著降低;能导致神经活性配体-受体通路中Prlr过度表达;会引起参与多条通路的Cyp26a1基因表达的显著下降。柴胡石油醚部位对由CUMS造模引起的生物钟基因Npas2、Per2和Rorc表达显著回调,其中对Npas2和Rorc回调作用明显,接近空白组;对胆汁分泌与合成相关通路中Cyp7b1、Nceh1和Kcnn2表达显著回调;对神经活性配体-受体通路中Prlr表达显著回调。柴胡石油醚部位对模型/正常大鼠肝组织中与代谢相关的Akr7a3、Gsta3和Ephx1表达远远高于未给药组。结论:1、CUMS造模引起的抑郁症与神经递质变化和昼夜节律系统紊乱有关。2、柴胡石油醚部位具有活性,可能通过调节体内单胺类、氨基酸类及乙酰胆碱类神经递质;降低参与昼夜节律的Npas2和Rorc的过度表达,从而调节由ACTH和CORT分泌过多引起的情绪紊乱;参与胆汁分泌与合成的Cyp7b1、Nceh1和Kcnn2的表达;降低神经活性配体-受体相互作用中的Prlr的表达来发挥抗抑郁作用。另外,其在肝组织中代谢作用可能与解毒有关。3、柴胡石油醚部位对模型与正常动物的调节通路大部分相似,表明其作用基本相同。