目的:血清促甲状腺激素（TSH）水平升高不仅与甲状腺功能减退有关,而且和心血管疾病、死亡和甲状腺癌的发生风险相关。在全国碘营养与甲状腺疾病调查中发现:经过20余年的全民食盐加碘,我国普通人群血清TSH水平显著升高,而且与碘摄入量明显相关。因此慢性碘过量是造成高TSH血症的危险因素之一。但是其发病机制目前尚未完全明确。人群研究显示亚临床甲减（SCH）的患病率随碘摄入量的增加而升高,该现象仅见于非自身免疫性SCH,而甲状腺自身免疫抗体的滴度则呈下降趋势。因此,慢性碘过量致TSH水平升高并非通过自身免疫性甲状腺炎的作用。动物研究证明慢性碘过量导致Wistar大鼠发生了单纯高TSH血症,其与垂体D2的活性减低有关,为下丘脑-垂体成因说提供了研究基础和理论依据。然而,在高碘致高TSH血症的非自身免疫机制中,仅用垂体D2的活性变化及其泛素化机制解释是不够的。垂体是合成和分泌TSH的器官,在垂体中不仅存在TSH细胞,也存在具有TSH细胞转分化潜能的合成其他激素的细胞和调节TSH合成的旁分泌细胞。目前尚无研究报道慢性碘过量时垂体内多种细胞的增殖和相互转分化对高TSH血症的影响。为了从更广泛的视角获得慢性碘过量时垂体细胞在特性和功能上的动态变化,本研究利用单细胞测序技术将正常对照和高碘干预的Wistar大鼠垂体分别进行细胞簇的分类,通过差异基因的对比、差异基因通路的富集来检测垂体细胞在m RNA水平上的变化,从而更全面、具象的阐明垂体在慢性碘过量致高TSH血症中的作用及其机制。研究方法:第一部分:4周龄Wistar大鼠60只通过正常饮食伴正常饮水（碘适量组,NI）和正常饮食伴50倍高碘饮水（高碘组,HI）喂养24周,以建立正常对照和慢性碘过量诱导的高TSH血症模型。喂养0、4、8、12、18和24周称重并留尿,喂养12、18和24周完成颈部静脉采血,留取血清。24周时心脏灌流后处死大鼠,大鼠留取下丘脑、垂体、甲状腺并称重。电感耦合等离子体-质谱（ICP-MS）法确定大鼠尿碘水平,酶联免疫吸附测定法（Elisa）完成血清促甲状腺激素释放激素（TRH）、血清TSH、总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总四碘甲状腺原氨酸（TT4）、甲状腺球蛋白（Tg）、抗氧化酶和垂体其他内分泌激素水平的测定,以及垂体组织TRH、TT3和TT4水平的测定,免疫荧光法测定垂体组织1型脱碘酶（D1）和2型脱碘酶（D2）的表达,测定D1和D2的活性。第二部分:上述大鼠喂养24周并建立正常对照和慢性碘过量诱导的高TSH血症模型后,NI组和HI组分别随机留取10只完整新鲜的大鼠垂体组织,剪碎经酶消化后分别制备成符合要求的NI组和HI组的单细胞悬液。符合质检标准后经过洗涤、重悬,将两份单细胞悬液分别制备为合适浓度,运用10X Genomics Chromium TM进行上样,步骤包括单细胞进样、微磁珠附着、油滴隔离和涨破收集。在制备油滴包裹物（GEMs）完成后,将GEMs吸出进行反转录及c DNA文库构建。库检合格后,将获得的转录组文库上机测序。采用Illumina Hiseq PE150测序策略,获得原始测序序列后,使用Cell Ranger对垂体细胞进行分群和差异基因分析,后续采用Seurat软件对这些差异基因进行功能富集,从而鉴定慢性碘过量导致TSH水平升高时的相关差异基因、差异细胞亚群和差异基因通路。第三部分:不同浓度的碘化钾对大鼠垂体瘤GH4C1细胞系进行72小时干预,按浓度分为无碘（DI）组、正常碘（NI）组、10倍高碘（10HI）组、100倍高碘（100HI）组以及1000倍高碘（1000HI）组。免疫荧光法测定D1、D2、Secisbp2、NIS、PI3K/AKT/GSK-3β/NRF2-Keap1信号通路的蛋白水平。分别提取各组细胞RNA,用q PCR法测定上述指标的m RNA表达。ELISA法测定细胞上清TT3、TT4的水平,以及D2的活性。荧光探针DCFHDA检测活性氧（ROS）水平。水溶性四唑盐-1（WST-1）法测定细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、钼酸胺法测定细胞内过氧化氢酶（CAT）水平以评价细胞抗氧化能力。结果:第一部分:高碘喂养后,相比于NI组,HI组的尿碘水平显著升高,而体重未见明显变化。相比于NI组,24W时HI组大鼠脑垂体的相对质量显著增加。喂养12W、18W和24W时,关于血清TSH,相比于NI组,HI组大鼠的血清TSH水平随着碘干预时间的延长而逐渐升高,在24W时TSH水平显著升高。关于血清TT3和TT4,随着碘干预时间的延长,相比于NI组,HI组的血清TT3和TT4水平以及血清TT3/TT4的比值无显著变化。关于血清TRH,相比于NI组,HI组的血清TRH在12W时显著降低,而在18W和24W时恢复NI水平。关于垂体TRH、TT3和TT4,相比于NI组,24W时HI组的TRH水平显著降低,TT3水平显著降低,TT4水平显著升高,TT3/TT4的比值显著降低。关于垂体的其他内分泌激素,相比于NI组,HI组的催乳素（PRL）、卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素（LH）水平在12W时有变化,但在18W后均恢复NI水平。关于抗氧化酶水平,相比于NI组,HI组的各个时点血清SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活力显著降低。关于脱碘酶,相比于NI组,24W时HI组垂体组织的D1和D2的蛋白表达水平显著减低,D1和D2酶活力显著降低。第二部分:单细胞测序结果显示,相较于NI组,HI组垂体细胞数量显著增加,其中TSH细胞簇、具备TSH合成能力的多潜能多激素细胞（Mult）簇以及调节TSH合成旁分泌作用的滤泡星形胶质细胞（FSC）簇的细胞占比显著增加。TSHα、TSHβ亚基的基因表达显著上调,TRH受体基因下调、HPT轴负反馈抑制相关基因显著下调、脱碘酶及其合成代谢相关基因（硒代半胱氨酸合成中心、泛素化与去泛素化、内质网应激、营养信号）显著下调、脱碘酶D1与甲状腺激素转运体Mct8的共定位显著减少,NIS基因表达无显著差异。基因通路富集分析显示,相较于NI组,HI组过氧化物酶体通路中与活性氧（ROS）合成相关的基因显著上调,而PI3K-AKT信号通路显著下调。进一步差异基因分析显示,PI3K-AKT-GSK3β/NRF2-Keap1的通路基因显著下调,其下游的抗氧化酶SOD、CAT和GSH-px等基因的表达也显著下调。第三部分:我们首次证实GH4C1细胞有NIS蛋白表达。在干预72小时后,随碘干预的浓度梯度升高,关于TT3/TT4的比值,相较于NI组,10HI组的TT3/TT4比值升高,1000HI组的TT3/TT4比值下降。关于D2的活性,NI组D2的活性最高,相较于NI组,10HI组、100HI组和1000HI组的D2活性均显著降低。关于D2的蛋白水平,相较于NI组,10HI组无显著差异,100HI组和1000HI组D2蛋白水平显著降低。关于D1的蛋白水平,相较于NI组,10HI组和100HI组的D1蛋白水平显著升高,而1000HI组D1蛋白水平降低,D1活性与蛋白水平的变化一致。与此同时,我们对不同碘浓度梯度干预后的细胞氧化与抗氧化能力进行测定。关于ROS,与NI组相比,10HI组和100HI组的ROS活性显著降低,而1000HI组未见明显降低。关于抗氧化酶,相较于NI组,10HI、100HI和1000HI组抗氧化酶水平随碘浓度升高呈递减趋势,10HI组的CAT和SOD水平显著升高,1000HI组的CAT和SOD水平显著降低。关于PI3K、AKT和GSK3β,相较于NI组,10HI组和100HI组的蛋白磷酸化水平均出现显著升高,并随碘浓度升高,蛋白磷酸化水平开始下降。关于NRF2蛋白,相较于NI组,10HI组和100HI组的NRF2蛋白显著升高,1000HI的蛋白水平显著降低。而Keap1在10HI及以上组的蛋白水平显著降低。结论:1、慢性碘过量时,垂体D2和D1活性下降,从而使T4向T3的转化减少,T3介导的对TSH合成的负反馈抑制作用减弱,TSH合成增加。2、慢性碘过量时,垂体中TSH细胞的数量增加,能够分化和转分化为TSH细胞的垂体细胞数量增加。3、慢性碘过量时,碘通过NIS通道进入垂体细胞,抑制PI3K-AKT-GSK3β信号通路的磷酸化水平,从而下调NRF2-Keap1信号通路,使垂体细胞的抗氧化酶水平下降,抗氧化能力减弱,抑制脱碘酶合成和活性。综上,慢性碘过量通过增加TSH细胞数量、通过抑制垂体脱碘酶D2和D1的活性、降低垂体细胞抗氧化能力,参与碘过量导致的TSH水平升高的机制。