论文部分内容阅读
目的：缺血性疾病是临床上难治性疾病，利用转基因技术刺激缺血部位生长出健康有效的新生血管成为治疗缺血性疾病的研究热点。最近的研究表明，VEGF基因和Angiopoietin1基因在血管生成的早期和晚期阶段分别发挥着重要作用。腺相关病毒基因转移系统是一种比较有前途的基因转移系统。本课题建立一个可同时表达人血管生长素1(Angiopoietin1)和血管内皮生长因子(VEGF)的重组腺相关病毒载体基因转移系统，为下一步的研究做准备工作。 方法：根据Gene Bank提供的原始序列设计引物Pang1和Pang2，以骨髓cDNA文库为模版，利用PCR技术，获取目的基因Angiopoietin1。根据质粒phVEGF的原始序列设计引物Pvegf1和Pvegf2，利用PCR技术，获取目的基因VEGF165。Angiopoietin1的上游含有HindⅢ酶切位点，下游含有BamHⅠ酶切位点，VEGF165的上游含有BglⅡ位点，下游含有BamHⅠ位点。质粒pAAV-MCS中含有BamHⅠ、BglⅡ、HindⅢ、NotⅠ、XhoⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、BspHⅠ、KspⅠ酶切位点。而质粒pZero++中几乎含有所有常用的酶切位点，利用这一特点，可很容易的找到与上述位点粘端互补的酶切位点，通过体外DNA重组技术，将Angiopoietin1和VEGF165基因亚克隆进入pAAV-MCS。 结果：测序证实PCR产物Angiopoietin1和VEGF165基因与Gene Bank提供的原始序列完全一致。酶切鉴定与测序鉴定证实重组质粒pAAV VEGF，pAAV Angiopoietin1和pAAV Angiopoietin1-VEGF与预期结果完全一致。在新的重组质粒中，Angiopoietin1和VEGF165各有一套CMV启动子和poly A终止子系统，保证了两种基因的共同表达。 结论：人Angiopoietin1和VEGF基因AAV共表达系统的构建成功，为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。