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研究背景：
Ⅱ型成簇规律性间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedprotein9,CRISPR/Cas9）是一种高效的基因编辑系统。而眼睛则是最为理想的基因编辑的靶器官，其原因在于，眼睛位于人体表面位置，且不会受到免疫系统的攻击。遗传性眼病都有明确的致病基因，例如，X连锁青少年视网膜劈裂症（X-linkedjuvenileretinoschisis，XLRS）与RS1的突变有关、常染色体显性视神经萎缩（autosomaldominantopticatrophy，ADOA）与OPA1的突变有关、年龄相关性黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration，AMD）与VEGFA有关。在对遗传性眼病致病基因的编辑以及基因治疗上，CRISPR/Cas9系统已经取得了一定的进展。在目前的研究中，为了将CRISPR/Cas9递送进入哺乳动物细胞或者植物细胞中，最为常用的方法是通过质粒的转染或者病毒的递送。然而，这些方法都是通过外源性DNA的形式递送CRISPR/Cas9系统，外源性DNA具有潜在的随机整合到靶细胞DNA中的风险，带来了生物安全问题。用RNA引导核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）形式的核酸酶进行基因编辑是一种有前景的基因编辑和基因治疗策略。这种方法有两个优点，其一是不会有外源性基因整合到靶细胞基因组中，其二是可以降低基因编辑的毒性。并且，由于Cas9-RNP的在细胞内的迅速降解，RNP形式的基因编辑显示出了比传统方法更低的脱靶效应。金黄色葡萄球菌成簇规律间隔短回文重复相关蛋白9（Staphylococcusaureusclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat-associatedprotein9,SaCas9）是Cas9家族的一员。与传统的化脓性链球菌成簇规律间隔短回文重复相关蛋白9（Streptococcuspyogenesclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat-associatedprotein9,SpCas9）相比，SaCas9蛋白更小，并且具有更高特异性和更低的脱靶风险，其RNP形式的基因编辑尚未得到报道。
研究目的：
1.诱导SaCsa9在大肠杆菌BL21中高水平可溶性表达，建立SaCas9的纯化体系；
2.测试SaCas9-RNP的基因编辑效率；
3.利用SaCas9-RNP对三种眼科疾病相关基因（RS1、OPA1和VEGFA）进行编辑；
4.利用SaCas9-RNP修复含有X连锁青少年视网膜劈裂症致病突变的细胞系。
研究方法：
1.构建SaCas9的表达载体，使用转化的方法递送入大肠杆菌BL21内，使大肠杆菌BL21表达SaCas9蛋白，优化蛋白表达条件，并使用镍亲和层析纯化，得到SaCas9蛋白；
2.构建单向导核糖核酸（singleguideRNA，sgRNA）模板，使用体外转录的方法得到sgRNA；
3.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增目的基因，在体外加入SaCas9、sgRNA和反应缓冲液，进行SaCas9-RNP活性的体外测试；
4.设计靶向EGFP基因的sgRNA，将SaCas9和sgRNA用转染的方法递送进入表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）的人类细胞中，利用流式分析荧光的泯灭来测试SaCas9-RNP在细胞内的编辑效率；
5.设计靶向RS1、OPA1和VEGFA的sgRNA，将它们分别与SaCas9一起转染进入人类细胞，用T7核酸内切酶Ⅰ（T7E1）检测其编辑效率，用高通量测序检测其编辑效率、编辑窗以及脱靶效应；
6.设计靶向X连锁青少年视网膜劈裂症致病突变的RS1（mRS1）的sgRNA，将SaCas9和sgRNA转染进入mRS1与EGFP融合表达的人类细胞系中，利用T7E1和流式对其治疗X连锁青少年视网膜劈裂的能力进行分析。
研究结果：
1.我们成功优化了SaCas9在大肠杆菌BL21中的表达条件，并成功利用镍亲和层析纯化得到SaCas9蛋白；
2.流式分析显示，SaCas9-RNP在细胞内成功地对EGFP进行了基因编辑；WesternBlotting结果显示，SaCas9蛋白在体内快速降解；
3.T7E1和高通量测序结果显示，我们利用SaCas9-RNP成功地对眼病相关基因进行了编辑；高通量测序结果显示，SaCas9-RNP进行的基因编辑几乎检测不到脱靶；
4.T7E1和流式结果显示，我们利用SaCas9-RNP成功修复了一部分RS1致病突变的细胞。
研究结论：
1.我们构建并优化了SaCas9蛋白的表达、纯化系统；
2.SaCas9-RNP高效、安全地编辑了遗传性眼病的致病基因，是一种强大、可靠的基因编辑工具；
3.SaCas9-RNP作为一种基因治疗工具，在遗传性眼病的基因治疗上具有巨大的潜力。
Ⅱ型成簇规律性间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/CRISPR-associatedprotein9,CRISPR/Cas9）是一种高效的基因编辑系统。而眼睛则是最为理想的基因编辑的靶器官，其原因在于，眼睛位于人体表面位置，且不会受到免疫系统的攻击。遗传性眼病都有明确的致病基因，例如，X连锁青少年视网膜劈裂症（X-linkedjuvenileretinoschisis，XLRS）与RS1的突变有关、常染色体显性视神经萎缩（autosomaldominantopticatrophy，ADOA）与OPA1的突变有关、年龄相关性黄斑变性（age-relatedmaculardegeneration，AMD）与VEGFA有关。在对遗传性眼病致病基因的编辑以及基因治疗上，CRISPR/Cas9系统已经取得了一定的进展。在目前的研究中，为了将CRISPR/Cas9递送进入哺乳动物细胞或者植物细胞中，最为常用的方法是通过质粒的转染或者病毒的递送。然而，这些方法都是通过外源性DNA的形式递送CRISPR/Cas9系统，外源性DNA具有潜在的随机整合到靶细胞DNA中的风险，带来了生物安全问题。用RNA引导核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）形式的核酸酶进行基因编辑是一种有前景的基因编辑和基因治疗策略。这种方法有两个优点，其一是不会有外源性基因整合到靶细胞基因组中，其二是可以降低基因编辑的毒性。并且，由于Cas9-RNP的在细胞内的迅速降解，RNP形式的基因编辑显示出了比传统方法更低的脱靶效应。金黄色葡萄球菌成簇规律间隔短回文重复相关蛋白9（Staphylococcusaureusclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat-associatedprotein9,SaCas9）是Cas9家族的一员。与传统的化脓性链球菌成簇规律间隔短回文重复相关蛋白9（Streptococcuspyogenesclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat-associatedprotein9,SpCas9）相比，SaCas9蛋白更小，并且具有更高特异性和更低的脱靶风险，其RNP形式的基因编辑尚未得到报道。
研究目的：
1.诱导SaCsa9在大肠杆菌BL21中高水平可溶性表达，建立SaCas9的纯化体系；
2.测试SaCas9-RNP的基因编辑效率；
3.利用SaCas9-RNP对三种眼科疾病相关基因（RS1、OPA1和VEGFA）进行编辑；
4.利用SaCas9-RNP修复含有X连锁青少年视网膜劈裂症致病突变的细胞系。
研究方法：
1.构建SaCas9的表达载体，使用转化的方法递送入大肠杆菌BL21内，使大肠杆菌BL21表达SaCas9蛋白，优化蛋白表达条件，并使用镍亲和层析纯化，得到SaCas9蛋白；
2.构建单向导核糖核酸（singleguideRNA，sgRNA）模板，使用体外转录的方法得到sgRNA；
3.聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增目的基因，在体外加入SaCas9、sgRNA和反应缓冲液，进行SaCas9-RNP活性的体外测试；
4.设计靶向EGFP基因的sgRNA，将SaCas9和sgRNA用转染的方法递送进入表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）的人类细胞中，利用流式分析荧光的泯灭来测试SaCas9-RNP在细胞内的编辑效率；
5.设计靶向RS1、OPA1和VEGFA的sgRNA，将它们分别与SaCas9一起转染进入人类细胞，用T7核酸内切酶Ⅰ（T7E1）检测其编辑效率，用高通量测序检测其编辑效率、编辑窗以及脱靶效应；
6.设计靶向X连锁青少年视网膜劈裂症致病突变的RS1（mRS1）的sgRNA，将SaCas9和sgRNA转染进入mRS1与EGFP融合表达的人类细胞系中，利用T7E1和流式对其治疗X连锁青少年视网膜劈裂的能力进行分析。
研究结果：
1.我们成功优化了SaCas9在大肠杆菌BL21中的表达条件，并成功利用镍亲和层析纯化得到SaCas9蛋白；
2.流式分析显示，SaCas9-RNP在细胞内成功地对EGFP进行了基因编辑；WesternBlotting结果显示，SaCas9蛋白在体内快速降解；
3.T7E1和高通量测序结果显示，我们利用SaCas9-RNP成功地对眼病相关基因进行了编辑；高通量测序结果显示，SaCas9-RNP进行的基因编辑几乎检测不到脱靶；
4.T7E1和流式结果显示，我们利用SaCas9-RNP成功修复了一部分RS1致病突变的细胞。
研究结论：
1.我们构建并优化了SaCas9蛋白的表达、纯化系统；
2.SaCas9-RNP高效、安全地编辑了遗传性眼病的致病基因，是一种强大、可靠的基因编辑工具；
3.SaCas9-RNP作为一种基因治疗工具，在遗传性眼病的基因治疗上具有巨大的潜力。