论文部分内容阅读
替莫唑胺(TMZ)是目前临床使用的一线抗神经胶质瘤药,但是其在使用过程中出现了耐药性问题,研究表明TMZ的耐药性主要与肿瘤细胞中的06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达及错配修复(MMR)状态相关,这同时也限制了 TMZ的临床应用。因此开发和研究不依赖于MGMT和MMR的TMZ衍生物具有重要意义。新型的TMZ衍生物377和465化合物已成功合成,经细胞活性实验证实该类衍生物不受MGMT和MMR的限制,但是其作用机制还不清楚。为了研究377和465在长时间情况下对TMZ耐药的MGMT高表达细胞的增殖抑制作用,我们做了克隆形成实验,实验结果显示TMZ对SNB19V和SNB19M 的 IC50 值分别为 32.2μM 和 854.65μM,377 对 SNB19V 和 SNB19M 的IC50值分别为 17.86±7.3μM和>100μM,465 对 SNB19V 和 SNB19M 的 IC50值分别为14.34±2.92μM和31.83±8.66μM,说明MGMT可以修复TMZ和377化合物产生的损伤,而465化合物的作用则不依赖于MGMT。为了研究377和465化合物对内源性高表达MGMT的T98G细胞的增殖抑制作用,我们做了 MTT实验,结果显示377和465对T98G细胞的IC50值分别为62.5±6.93μM和33.09±3.42μM,说明377和465可以抑制内源性高表达MGMT的T98G细胞的增殖。为了探讨其他DNA修复途径对TMZ衍生物药理作用的影响,我们采用465联合PARP抑制剂NU1025观察碱基切除修复(BER)通路对其活性的影响,MTT数据显示联合PARP抑制剂NU1025前后,465化合物对SNB19V、SNB19M及 HCT116 细胞的 IC50值分别为 7.16±2.19 μ M 和 5.49±1.57 μ M,8.39±1.43 μ M和 6.03±1.99μM,29.99±0.21 μM 和 23.50±2.28 μM。接下来,DNA 损伤实验证明了 377和465化合物可以使TMZ耐药的碱基错配修复缺陷的结肠癌HCT116细胞和MGMT高表达的T98G神经胶质瘤细胞产生DNA双链断裂,且这种双链断裂不是由于DNA交联引起的。然后,为了研究同源重组修复(HR)途径对377和465化合物活性的影响,我们通过RNA干扰的方法敲低HR途径的关键蛋白Rad51,MTT数据显示在Rad51干扰前后377对HCT116细胞的IC50值为28.68±2 μM 和 27.74±1.51 μM,465 化合物 3.6±0.92 μM 和 3.08±0.13 μM,说明HR途径对377和465化合物的活性无影响。Western Blot结果显示465化合物在HCT116细胞中产生的DNA双链断裂最终引起了细胞凋亡,导致线粒体膜电位下降,可能是线粒体相关的内源性凋亡途径。同时我们发现465化合物可以下调HCT116细胞中MGMT和Rad51的表达。综上所述,TMZ衍生物377和465化合物在肿瘤细胞中产生的DNA损伤和细胞凋亡不依赖于MGMT和MMR,DNA损伤不是由DNA交联引起的,BER途径和HR途径对其作用也无影响。而且465化合物可以下调MGMT和Rad51表达。