目的：视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞因其独特的解剖、生理功能在眼后段特别是维护视网膜神经细胞功能等方面有其重要的作用，同时RPE细胞独特的免疫功能因素对于维持视网膜功能的稳定、损伤反应和损伤后康复也有及其重要的作用。继Hui用巨噬细胞诱发兔PVR形成模型的建立之后，引起对细胞因子和免疫因素在PVR形成作用中的注意。正常视网膜下腔具有一定的免疫赦免特征，RPE细胞对于维持视网膜下腔的免疫赦免地位，发挥着多方面的作用：诱导免疫耐受、抑制免疫活性细胞功能甚至诱导活化T细胞的凋亡、分泌细胞因子等免疫相关分子，通过自分泌或者旁分泌途径，参与免疫细胞反应的调节等；同时RPE细胞损伤后，常表现为免疫激活：分泌炎前因子或者其他免疫活性因子。因此深入了解RPE细胞的免疫调节机制，不仅对于临床早期检测RPE细胞相关性疾病，以及相关性治疗、建立体外有效抑制免疫反应的RPE细胞移植库等，具有理论研究和临床应用的双重意义。MHC作为主要的组织相容性抗原系统，是主要的同种异体移植抗原，其基因的多态性和免疫调节机制是基础免疫学和临床免疫学研究的热点，主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)作为启动MHC分子表达的主要调节因子，对MHC的表达起到至关重要的作用；Fas ligandt通过与其受体结合介导Fas阳性细胞凋亡，FasL／Fas途径是活化T细胞 第四军医大学博士学位论文死亡的主要机制之一，也是免疫赦免组织维持其状态的主要途径之一在最近的研究中发现，CllTA与FasL的转录因子NFAT存在可能的竞争性机制;CllTA受4种启动子的诱导表达，4种启动子有组织细胞的特异性。正常活体RPE细胞不表达MHC。lassH分子，存在一定程度的FasL表达，而在损伤和RPE细胞移植后存在RPE MHC cl a 5 sH分子的可诱导表达和某些情况下Fa sL的增强表达， FasL高表达可能参与脉络膜新生血管(CNv)内皮细胞的凋亡形成，是抑制CNv形成主要机制之一。本研究的目的就是，通过观察培养的RPE细胞三种免疫相关分子表达的水平和分析其相关性，观察三种损伤条件下动物RPE细胞免疫特征的改变，确定RPE细胞中特异的Cl ITA启动子，观察抑制RPE细胞特异Cl ITA启动子诱导免疫耐受和抑制RPE细胞增值的效果。 方法: 1.人RPE细胞的培养、纯化和观察参照王雨生方法，对5只意外伤亡的尸供眼眼，12h内进行移去眼前段组织，制作眼杯，混合酶消化法分离RPE细胞，Ficoll密度梯度分离纯化原代RPE细胞，酶消化同时处理人羊膜，RPE细胞接种到羊膜介质，进行模拟组织原原位的RPE细胞超微结构观察;用FITc标记的兔抗鼠IgG，抗HLA一DR单抗，PE标记或未标记的抗人FasL单抗，PE标记的抗人Fas单抗，进行免疫荧光双标记，通过FCM和激光共聚焦显微镜，观察Fa sL、 Fas以及MHC e 1 a 5 5 11分子表达的水平及其相关性。 2.制作正常眼组织以及PvR膜石蜡标本，进行三种免疫相关分子的免疫荧光染色，通过FCM或激光共聚焦显微镜观察三种分子的表达. 3.通过经巩膜热凝、810nm激光经瞳孔温热治疗(TTT)、532nm激光视网膜光凝等方法建立兔RPE损伤模型，不同时间点对术眼进行眼底彩色照相、ERG、OCT、FA/ICGA等临床观察，对不同时间点兔眼后段组织进行组织病理学、超微结构和免疫荧光组织化学观察. 6 第四军医大学博士学位论文 4.设计CxxTA启动子xxl、Iv和CxIT^特异引物，通过RT一PCR，确定经IFN一Y诱导刺激下RPE细胞特异的CllTA启动子，通过CsA和FK506的抑制作用，观察RPE细胞cllTA的抑制表达以及三种免疫相关分子表达的相关性。 结果: 1.多种酶混合方法分离经纯化处理的RPE细胞纯化率达到”%，细胞活化率达到95%以上，羊膜介导培养的RPE细胞存在类似于原位的细胞间连接，细胞顶端可见少量微绒毛，细胞染色质致密，胞浆电子密度较高，细胞器完整，线粒体结构清晰，显示RPE细胞旺盛的代谢;经IFN一gamma刺激下，RpE细胞HL^一DR表达由9.7%上升到67.9%，FasL由88.7%降到59.1%，Fas表达低于5%，而且刺激前后没有明显改变;三种免疫相关分子主要分布于RPE细胞膜，MHC。lassH分子表达与FasL分子的表达存在一定的分布相关性，Fas分布与二者不一致。 2.经巩膜热凝诱导RPE损伤后兔ERGb波波幅密度普遍降低，降低幅度达到”%一6706，a，b波峰潜时相对稳定;OCT显示局部脉络膜毛细血管层消失，早期RPE层、神经上皮层水肿增厚，反光增强，部分RPE层中断消失;FA显示早期RPE水肿形成的低荧光区，遮蔽脉络膜荧光，损伤灶边荧光缘渗漏，4kw后FA影像稳定;同步工cGA显示早期局部脉络膜荧光消失，周边脉络膜荧光渗漏较FA不明显，4kw后IcGA影像稳定，3m后出现同步ICGA造影证实，FA观察到晚期损伤灶显著的荧光渗漏即脉络膜新生血管(CNv)的形成;电镜观察到损伤部位CNv的形成。免疫荧光染色显示损伤部位RPE细胞高表达HLA一DR分子，FasL表达减少.Fas染色结果无明显改变。 3.RT一PCR结果显示IFN一ganuna诱?