目的:动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,其发病机制较复杂。现有证据表明,动脉内皮细胞发生功能障碍是动脉粥样硬化病变的第一步,当内皮损伤后,会促使单核细胞聚集到内皮下,吞噬修饰过的低密度脂蛋白,特别是氧化型低密度脂蛋白胆固醇,形成巨噬泡沫细胞,然后泡沫细胞积聚、坏死或凋亡进一步促进粥样硬化斑块的发展,最终导致严重的心血管疾病的发生^[1]。炎症作为一个重要因素,贯穿动脉粥样硬化的每个发展阶段,与年龄、糖尿病、高血压、高脂血症、吸烟等多种危险因素有关。炎症不仅可以改变动脉内皮细胞、平滑肌细胞的固有功能,还可以使得脂质过氧化,成为氧化型低密度脂蛋白,对单核细胞具有趋化性,使其募集增殖,分化成为巨噬泡沫细胞,分泌活性细胞分子增加,参与动脉粥样硬化的形成。而修饰后的氧化型低密度脂蛋白又会作为抗原进一步加剧动脉血管的炎症反应,最终影响斑块的稳定性^[2-4]。因此,通过抗炎作用来减轻动脉粥样硬化已经得到越来越多的研究认可^[5-7]。目前针对动脉粥样硬化的药物治疗,尤其是他汀类药物的应用,已经对降低心血管疾病的风险起到明显的效果^[8]。他汀类药物在降脂的同时,还具有抗炎作用,使心血管疾病患者获益。但是,许多患者存在不能耐受他汀类药物或不能遵循长期治疗,依从性较差等原因,不能达到预期降脂目标。而且一些大型临床对照试验表明,对于减少心血管病的风险,包括他汀类药物的治疗仍然差强人意。部分患者在应用他汀类药物治疗的同时仍继续遭受预期的心血管疾病事件的发生。因此,寻找新的治疗动脉粥样硬化的方法,通过有效降脂、减轻炎症或抑制泡沫细胞形成等方面来缓解动脉粥样硬化发生发展是有必要的。越来越多的研究显示,干细胞在组织修复、抗炎等方面可以发挥重要作用,尤其是间充质干细胞,其抗炎及调节免疫的功能目前已经得到许多实验的证实。MSCs是具有自我更新和多向分化潜能的干细胞。源于MSCs易于分离培养、容易体外扩增,以及低免疫原性等特点,在诸多实验方向得到广泛应用研究。目前,对MSCs的作用已经应用到动脉粥样硬化领域。将小鼠骨髓间充质干细胞经尾静脉注射到动脉粥样硬化模型小鼠体内,可观察到动脉粥样硬化的斑块面积较对照组减少,其作用机制有研究认为是MSCs能够减少氧化低密度脂蛋白对血管内皮的损伤,有研究认为是MSCs能够调节巨噬细胞等多种炎性细胞的作用,通过抑制炎症反应来抑制斑块形成。还有研究应用小鼠皮肤来源MSCs治疗动脉粥样硬化,同样观察到斑块面积的减少,其作用机制涉及增加调节性T细胞的作用以及抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化。另外还有体外实验证实MSCs可以诱导巨噬细胞向M2型极化,可以旁分泌多种细胞因子调节炎症及免疫反应,从多方面抑制动脉粥样硬化的发生发展。MSCs最早在骨髓中发现,其后在脂肪、肌肉、骨膜、牙髓、滑膜等多种组织发现存在这种细胞。人羊膜间充质干细胞（Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells,hAMSCs）是从人羊膜分离出来的一种间充质干细胞,不仅具有显著的自我更新能力及跨系跨胚层多系分化潜能,且相对胚胎干细胞和其它成体干细胞更容易获得,无伦理争议,无致瘤风险,不表达MHC-II类抗原,仅表达少量的MHC-I类抗原,免疫原性低,还具有分泌免疫抑制因子、神经营养因子等多种生物活性因子的强大旁分泌或自分泌功能。这些特性使得hAMSCs在组织工程、细胞治疗、基因治疗等相关再生医学领域具有不可估量的临床应用价值。研究显示,hAMSCs的条件培养液能明显促进内皮细胞的增殖、迁移以及成管能力。应用hAMSCs的条件培养液培养细胞不会对细胞造成毒性损伤,还会抑制LPS刺激巨噬细胞产生炎症因子。因此,我们将hAMSCs通过尾静脉注射的方式从体外输注到给予高脂饮食的载脂蛋白E基因敲除小鼠体内,观察输注hAMSCs是否会对小鼠动脉粥样硬化的发生发展有影响,并探讨hAMSCs调节小鼠血管炎症反应的作用,以及hAMSCs的旁分泌功能是否参与其中并起到作用。方法:原代提取hAMSCs,经过培养鉴定后选取第三代到第六代的细胞进行实验。在动物实验部分,购买7周龄载脂蛋白E基因敲除的小鼠从8周龄开始给予高脂饮食构建动脉粥样硬化模型。第一批18只小鼠作研究动脉粥样硬化形成组,从给予高脂饮食的同时就开始干预,其中6只经尾静脉注射hAMSCs（5x10⁵个细胞悬浮于150ul的PBS中）,6只经尾静脉注射相同剂量150ul的PBS,另外6只不给予注射干预作为阳性对照组,每两周注射一次,共注射5次,干预10周后处死小鼠。其余18只小鼠作为第二批,饲以8周高脂饮食后开始干预,研究对已形成斑块影响。同样6只经尾静脉注射hAMSCs（5x10⁵个细胞悬浮于150ul的PBS中）,6只经尾静脉注射相同剂量150ul的PBS,另外6只不给予注射干预作为阳性对照组,每两周注射一次,共注射5次,干预10周后处死小鼠,收集并处理组织标本。在处死小鼠前,测量体重,然后心尖取血,得到血清用以比较血脂指标的差异。对主动脉根部血管进行石蜡切片,HE染色评价斑块面积差异。对从主动脉弓到双侧髂动脉的整根血管提取总RNA和总蛋白,通过qRT-PCR和Western Blot的方法观察注射hAMSCs干预对小鼠血管炎症因子表达的影响。细胞实验部分,收集hAMSCs的条件培养液,探讨hAMSCs旁分泌功能对oxLDL刺激下的巨噬细胞（THP-1细胞经佛波酯作用分化形成）增殖和炎症反应的影响。MTS实验检测增殖情况。对与hAMSCs Transwell间接共培养或应用hAMSCs条件培养液培养后的巨噬细胞提取总RNA和总蛋白,通过qRT-PCR和Western Blot的方法分析hAMSCs旁分泌功能对oxLDL刺激下的巨噬细胞炎症因子表达的影响,通过Western Blot实验检测p65和IкBα的磷酸化差异探讨对巨噬细胞炎性相关通路NF-кB通路的作用。结果:原代提取的人羊膜间充质干细胞呈现长梭形、多角样贴壁生长,传至第3代以后细胞呈现成纤维样形态、鱼群状分布,长满时会出现漩涡样生长。流式鉴定hAMSCs结果示CD90（+）、CD44（+）、SSEA-4（+）、CD31（-）、CD45（-）、HLA-DR（-）。动物实验部分,两批小鼠各组间小鼠体重、血脂水平没有统计学差异。HE染色结果显示,第一批小鼠中经尾静脉注射hAMSCs组的小鼠主动脉根部血管斑块面积明显低于注射PBS组以及未给予注射干预的Control组,注射PBS组与未给予注射干预的Control组之间比较斑块面积没有明显差别。对于第二批小鼠,同样可以看到经尾静脉注射hAMSCs组的小鼠主动脉根部血管斑块面积明显低于注射PBS组以及未给予注射干预的Control组,注射PBS组与未给予注射干预的Control组之间比较斑块面积没有明显差别,比较第二批经尾静脉注射hAMSCs组的小鼠与第一批未加干预的Control组,斑块面积没有明显差异,说明斑块形成后再给予注射hAMSCs对已经形成的斑块没有逆转作用。qRT-PCR和Western Blot结果显示两批小鼠中经尾静脉注射hAMSCs干预组的促炎因子TNFα表达较另外两组降低,抗炎因子IL10表达较另外两组增加。细胞实验部分,经MTS实验对巨噬细胞增殖情况检测分析后,选择的实验条件为佛波酯100ng/ml作用于THP-1细胞24小时后使其贴壁变为巨噬细胞后,再应用浓度为50mg/L的oxLDL作用于巨噬细胞24小时,然后收集细胞进行实验分析。从MTS实验结果可以看到oxLDL能够刺激巨噬细胞增殖。然后我们收集hAMSCs的条件培养液来培养巨噬细胞,结果显示用hAMSCs条件培养液培养巨噬细胞后,能明显抑制oxLDL对巨噬细胞的增殖刺激。qRT-PCR结果显示随着oxLDL浓度的升高,刺激巨噬细胞产生促炎因子TNFα明显增加,抗炎因子IL10没有明显变化。而用hAMSCs与巨噬细胞Transwell间接共培养,或是应用hAMSCs条件培养液培养巨噬细胞,都能减少oxLDL对巨噬细胞的炎症刺激,使促炎因子TNFα表达降低,抗炎因子IL10表达升高。应用hAMSCs的条件培养液培养巨噬细胞后,可以下调NF-кB通路的抑制因子IкBα的磷酸化,同时下调NF-кB通路的关键分子p65的磷酸化,抑制NF-кB通路的激活。结论:hAMSCs可以抑制载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的形成,延缓斑块的进展,但对于已经形成的斑块不能起到逆转作用。hAMSCs通过对NF-кB信号通路的调节来抑制oxLDL对巨噬细胞的炎症刺激,抑制巨噬细胞的增殖,来实现对小鼠血管的炎症抑制作用,从而减少斑块的形成。