碱性磷酸酯酶（Alkaline Phosphatase，简称AP，EC3.1.3.1）是一种磷酸单酯酶，可作为工具酶以及同位素标记应用于分子生物学各项研究。近年来，一类能够在极度高温环境下生存的生物引起了国内外科学家们的关注，研究者们发现，这些生物的酶具有特有的结构和功能，即很高的耐热性和70℃以上的最适反应温度，有些酶在110℃甚至更高的温度都有活性。高度的耐热性以及较高的最适反应温度使得这些酶类成为研究蛋白质结构与功能关系以及蛋白质耐热机制的极好的模型材料。 本实验采用亚硝基胍和PCR诱变法获得了200余个耐热碱性磷酸酯酶基因的随机突变体。我们对其中八个突变体进行了核苷酸序列的测定和突变体基因的原核表达、表达产物的分离纯化、表达产物的酶活、最适反应温度、热稳定性等指标的测定；并将所得到的TAP全序列提交到丹麦技术大学（Technical University of Denmark）CBS中心的CPHmodels服务器（http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）进行高级结构预测，在获得了与突变体具有最大相容性的已知结构的大肠杆菌碱性磷酸酶（BAP）的一个突变体（D153hd330n）A链的高级结构之后，采用分子模拟的方法模拟出突变体酶蛋白前319肽的三级结构，同时使用SWISS-PORT的Swiss-PDBviewer软件对TAP突变体进行了二级结构预测，分析了引起耐热性变化的机理。取得的主要研究结果如下： 1)8个突变体的突变情况： 3号突变体 核苷酸CCC→CUC¹²⁷¹ 氨基酸P→L⁴²⁴ 5号突变体 核苷酸CGG→CGA⁶⁶³ GUG→AUG¹⁰⁹³ 氨基酸V→M³⁶⁵ 25号突变体 核苷酸CUC→CUU²²¹ ACG→AUG³²³ 氨基酸T→M¹⁰⁸ 35号突变体 核苷酸CCC→CUC¹²⁷¹ CUG→GGG¹³⁴⁰ 氨基酸P→L⁴²⁴ L→G⁴⁴⁷ 52号突变体 核苷酸ACC→AUC⁴¹⁹ 氨基酸T→I¹⁴⁰ 所有突变体 核苷酸AGC→AAC²⁹⁹，氨基酸N→S¹⁰⁰ 2)8个突变体的最适反应温度：3、6、9、48号突变体的最适反应温度有所下降，而5、35、52号基本不变；25号略有上升。但所有突变体的最适反应温度都在70℃左右的小范围内变化。8个突变体的酶活力：几乎所有突变体在70℃时都表现出了最大酶活力；同样条件下诱导表达，25号和35号突变体的蛋白表达较其它突变体稍低。8个突变体酶的热稳定性：25号和35号热稳定性有所上升；5号、6号、9号、48号热稳定性有所