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研究目的： 1、探讨c-Jun是否与Fra1形成二聚体，及在神经母细胞瘤增殖过程的作用。 2、探讨JNK信号通路是否对Fra1蛋白存在调控作用，并进一步明确调控Fra1蛋白表达的具体机制。 研究方法： 1、体外培养SH-SY5Y细胞，裂解后进行免疫共沉淀实验，分别免疫沉淀c-Jun、Fra1抗原，并用免疫印迹方法从沉淀复合物中检测Fra1、c-Jun蛋白，检验c-Jun是否与Fra1形成二聚体。 2、用滴度为100MOI腺病毒(Ad)感染细胞，共分为4组，分别为对照组(转染绿色荧光蛋白)、Ad-c-Jun组、Ad-Fral组、Ad-c-Jun+Ad-Fra1组(后3组分别转染相应Ad)，免疫荧光染色检测感染率，MTT法检测细胞活力。 3、1）将细胞分成6组，1组为对照组[加入二甲基亚砜(DMSO)]，另5组为不同药物浓度SP600125组[分别加入浓度为0.5/1.0/2.0/5.0/10μM的c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制剂SP600125]。处理SH-SY5Y细胞8h后，免疫印迹法检测p-Fra1、Fra1等蛋白表达，选定合适的药物浓度。2）将细胞分为2组，分别为对照组[加入二甲基亚砜(DMSO)]、SP600125组[加入浓度为10μM的SP600125]，每组又分为处理4h、8h两个亚组，免疫印迹法检测p-Fra1、Fra1等蛋白表达。3）将细胞分为2组，分别为对照组[加入二甲基亚砜(DMSO)]、U0126组[加入浓度为20μM的MEKl/2抑制剂U0126]，每组又分为处理4h、8h两个亚组，免疫印迹法检测p-Fra1、Fra1等蛋白表达。 4、将细胞分为3组，分别为对照组[加入二甲基亚砜(DMSO)]、SP600125组[加入 SP600125]、U0126组[加入 U0126]。处理细胞12h后，用 BrdU掺入法及Hoechst33258核染色法统计细胞增殖情况。 5、用特异性JNK1/2/3 siRNAs、Fra1 siRNAs、c-Jun siRNAs转染 SH-SY5Y细胞，并设立对照组[加入Negative control]，免疫印迹方法检测JNK1/2/3、c-Jun、Fra1蛋白表达。 6、1）用RT-PCR方法检测对照组、U0126组、SP600125组Fra1转录水平。2）将细胞分为6组，分别为对照组[加入DMSO]、SP600125组[加入SP600125]、SP600125+MG132组[加入SP600125+蛋白酶体抑制剂MG132]、MG132组[加入MG132]、U0126组[加入U0126]、U0126+MG132组[加入U0126+MG132]，免疫印迹法检测Fra1等蛋白表达。3）用pshuttle-Fra1-IRES-GFP转染SH-SY5Y细胞，过表达Fra1蛋白，予上述同样处理，免疫印迹法检测Fra1等蛋白表达。 结果： 1、免疫共沉淀结果显示c-Jun和Fra1形成二聚体。 2、过表达c-Jun、Fra1后，4组细胞活力差异有统计学意义，其中对照组与Ad-c-Jun组差异无统计学意义，对照组与Ad-Fra1组差异有统计学意义，Ad-Fra1组与Ad-c-Jun+Ad-Fra1组差异有统计学意义。 3、Western blot结果表明：1）用SP600125抑制JNK信号通路可抑制Fra1及其磷酸化，且当其浓度为10μM时效果已相当明显。2）与对照组比较，抑制JNK信号通路4h时，Fra1蛋白及其磷酸化即有下降，8h抑制效果更佳；而ERK信号通路未被抑制。3）与对照组比较，抑制ERK信号通路4h及8h时，Fra1、p-Fra1、p-ERK均明显下降，而JNK信号通路未被抑制。 4、BrdU掺入及Hoechst33258核染色计数实验表明，抑制JNK信号通路、ERK信号通路可抑制细胞增殖，3组细胞活力差异有统计学意义，其中对照组与SP600125组、U0126组差异有统计学意义,SP600125组与U0126组差异无统计学意义。 5、Western blot结果表明：沉默JNK1/2/3表达，Fra1表达水平均下降；沉默Fra1表达，c-Jun表达水平无变化；沉默c-Jun表达，Fra1表达水平亦无改变。 6、1）RT-PCR结果显示：与对照组比较，U0126组Fra1转录水平下降，而SP600125组无明显变化。2）Western blot结果表明：与对照组比较，SP600125组Fra1表达下降，p-ERK无变化；SP600125+MG132组与SP600125组、MG132组比较，Fra1蛋白量恢复，p-ERK代谢减少；U0126+MG132组与U0126组、MG132组比较，Fra1、p-ERK蛋白量恢复不明显。3）过表达Fra1蛋白，予相同处理，可得到同样结果。 结论: 1、c-Jun和Fra1形成二聚体，两者协同促进SH-SY5Y细胞存活与增殖。 2、JNK调控Fra1并不依赖 c-Jun。 3、JNK有别于ERK信号通路的方式调控Fra1蛋白表达，主要通过泛素-蛋白酶体途径调控Fra1降解。