论文部分内容阅读
轮虫是一组微型后生动物。作为基础消费者,轮虫在水生食物网中发挥着重要作用。轮虫品种繁多,数目较大,在水产行业中被广泛用于水产品育苗;同时,轮虫作为江河、湖泊、池塘浮游动物的重要组成部分,对环境改善、环境监测方面也有重要作用。尽管轮虫在育苗及环境改善及监测方面有天然优势,其生产养殖过程中仍存在部分问题。这些问题主要包括轮虫寿命短、种群变化快、种群高峰期短。现有的技术难以满足轮虫在生产上的需要。因此研究轮虫衰老的影响因素就迫在眉睫。对此我们提出了两个假设:第一,通过研究个体轮虫的寿命延长,促使轮虫整体寿命延长,种群密度增大,进而延长轮虫的种群高峰期;第二,目前通过生态学手段无法解决轮虫高产稳产的问题,因此本实验拟通过分子生物学方法,研究控制轮虫衰老的生物学机理,从而实现轮虫的高产稳产。本研究所使用的轮虫为玛雅臂尾轮虫(Brachionus manjavacas),它的平均寿命约为10天;死亡的特征是纤毛,附件或内部器官缺乏运动,并经常伴有膜完整性的丧失,易于培养和观察,因此适合作为本次课题的实验材料。雷帕霉素是一种靶向TOR的抑制剂,目前在调节人体衰老过程中已得到广泛认可。m TOR是高分子量蛋白激酶,其反应和调节生物体细胞的许多过程,包括细胞的营养供应和有丝分裂。研究表明,雷帕霉素还可以通过产生活性氧ROS来影响细胞和生物的衰老过程。在一般情况下,体内很难检测到热休克蛋白的存在,但是当外界压力出现时,热休克蛋白就能够检测到。当m TOR磷酸化后,能够促进HSP90复合物的释放,同时显着降低包括HSP90在内的热休克蛋白的合成能力,但对HSP70没有影响。具体的调控机制有待进一步研究。本文在不同雷帕霉素浓度下,测定了玛雅臂尾轮虫的寿命、总繁殖量和生殖前期;克隆了TORC1、P70S6K和S6基因片段,并测定不同时间雷帕霉素在不同时间后的基因表达差异;测定了不同雷帕霉素浓度和时间下热休克蛋白HSP70,HSP90基因表达的差异;测定了不同雷帕霉素浓度下SOD,CAT的酶活性差异。1.雷帕霉素与轮虫寿命及生殖的影响实验结果表明,适当浓度的雷帕霉素对玛雅臂尾轮虫寿命及生殖均有正向调节。1.0μM、2.0μM、4.0μM和8.0μM浓度雷帕霉素处理下的轮虫平均寿命,相较于对照组分别延长了39.8%、54.1%、42.1%和15.3%。然而,在使用16μM浓度雷帕霉素处理时,轮虫的平均寿命仅有71.50±6.13 h,相较于对照组有明显减少(P<0.05)。整个实验结果呈先上升后下降趋势,最后甚至能够抑制轮虫寿命。2.0μM、4.0μM和8.0μM浓度雷帕霉素处理下的轮虫生殖前期相较于对照组分别延长了18.0%、18.8%和20.4%。相比之下,1.0μM浓度雷帕霉素处理下的轮虫,其生殖前期时长虽然高于对照组,但却无明显影响(P>0.05)。同样的,16.0μM浓度处理下的轮虫其生殖前期与对照组轮虫并无明显差异(P>0.05)。整个实验结果呈缓慢上升后下降趋势。1.0μM、2.0μM、4.0μM和8.0μM浓度雷帕霉素处理下的轮虫平均生殖量,相较于对照组有显著延长(P<0.05),分别增加了33.3%、62.9%、49.6%和31.3%,且在2.0μM浓度雷帕霉素处理下最多。然而,在使用16.0μM浓度雷帕霉素处理时,轮虫的平均生殖量仅有0.35±0.12个,相较于对照组有明显减少(P<0.05)。整个实验结果呈先上升后下降趋势,最后甚至能够抑制轮虫繁殖。2.雷帕霉素与TORC1、P70S6K和S6基因表达研究由Gen Bank得到的TORC1,P70S6K和S6基因片段,经由实时荧光定量PCR技术检测其基因表达量的变化。结果表明,TORC1,P70S6K和S6基因的m RNA表达量在总体上,呈现同一趋势:先上升后下降。TORC1基因表达量结果:在使用雷帕霉素处理轮虫12 h时,各浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显低于对照组(P<0.05)。24 h和36 h时,各浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显高于对照组(P<0.05)。48 h时,只有8.0μM和16.0μM浓度组下的轮虫m RNA表达量仍然明显高于对照组(P<0.05),但相较于36 h时,这两组轮虫的m RNA表达量也有明显下降,趋向于回归正常水平。P70S6K基因表达量结果:在使用雷帕霉素处理轮虫12 h时,2.0,4.0,8.0和16.0μM浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显高于对照组(P<0.05)。24 h和36 h时,所有浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显高于对照组(P<0.05)。48 h时,只有8.0μM和16.0μM浓度组下的轮虫m RNA表达量仍然明显高于对照组(P<0.05),但相较于36 h时,这两组轮虫的m RNA表达量也有明显下降,趋向于回归正常水平。S6基因表达量结果:在使用雷帕霉素处理轮虫12 h时,4.0μM和8.0μM浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显高于对照组(P<0.05),16.0μM时则明显低于对照组(P<0.05),而1μM,2μM无明显变化(P>0.05)。24 h和36 h时,各浓度组下的轮虫m RNA表达量都明显高于对照组(P<0.05)。48 h时,只有8.0μM和16.0μM浓度组下的轮虫m RNA表达量仍然明显高于对照组(P<0.05),但相较于36 h时,这两组轮虫的m RNA表达量也有明显下降,趋向于回归正常水平。3.雷帕霉素与HSP70,HSP90基因表达研究由Gen Bank得到的HSP70,HSP90基因片段,经由实时荧光定量PCR技术检测其基因表达量的变化。结果表明:在12 h时,1.0,2.0,4.0,8.0,16.0μM组均明显高于对照组(P<0.05)。24 h时,与对照组相比,全浓度组轮虫m RNA水平均有明显上升(P<0.05)。在36 h和48 h时,1.0,2.0,4.0μM组m RNA水平均明显高于对照组(P<0.05),其他组无明显差异(P>0.05)。整体上,各组的HSP90基因表达量均随浓度呈现先上升后下降的趋势。而雷帕霉素对HSP70基因表达量则无明显影响。基于二者有相同的信号分子4E-BP,此实验结果表明雷帕霉素对细胞的影响与4E-BP通路无关。4.雷帕霉素与轮虫抗氧化性玛雅臂尾轮虫暴露于不同浓度雷帕霉素24 h后,其体内SOD和CAT酶活性均随着雷帕霉素浓度升高而呈现先上升后下降趋势。2.0μM,4.0μM组轮虫SOD和CAT酶活性明显高于对照组(P<0.05),随着雷帕霉素浓度的升高,轮虫SOD和CAT酶活呈现先上升后下降的趋势。其中,雷帕霉素浓度为2.0μM时,轮虫SOD和CAT酶活力最高。