真核生物基因组中存在大量的重复序列，这些序列有着不同的生物学功能。目前，国内外还没有家驴重复序列相关研究报道，为研究家驴基因组重复序列，本文通过两次羟基磷灰石柱层析，分离纯化了家驴Cot0～Cot0.1 mol·s/L之间的基因组高度重复DNA序列，用于构建家驴基因组高度重复序列Cot文库，并对部分文库序列进行测序、分析、注释、最后提交至GenBank。通过对家驴基因组重复序列的分析，找到了驴特异性高度重复DNA序列(序列号：F1857206)。利用驴特异性高度重复Cot文库序列和已报道的马特异性高度重复序列(序列号：AJ937277)，本文建立了一种操作简单，使用方便，可行性强，可信度高的能够鉴定驴源、马源食品的快速实时荧光定量PCR方法。该方法鉴定驴肉马肉的检测限分别为0.02 ng、0.0003 ng；在混合DNA的检测中，其对驴肉和马肉的检测限分别为0.012％、0.0002％。在考察驴肉、马肉DNA混合比例与Ct值的线性关系，以及驴肉、马肉混合比例与Ct值的线性关系时，发现线性关系良好，R2值均在0.99以上。该方法能够起到保护消费者权利，打击假冒伪劣产品，稳定驴源、马源食品价格的作用。