论文部分内容阅读
目的 肌动蛋白(actin)聚合与解聚在细胞迁移,粘附,吞噬等过程中发挥关键作用, 但细胞外信号如何通过细胞内调节蛋白,协同调节肌动蛋白聚合与解聚,尚未清楚。本研究目的在于观察一肿瘤转移消失蛋白(MIM: Missing In Metastasis) 对细胞迁移的影响, 探讨其可能机制。 材料和方法 采用RT-PCR 检测MIM在细胞中的表达水平; 用病毒感染或质粒转染, 使成纤维细胞(NIH3T3),人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)和急性早幼粒白血病细胞(HL-60)稳定表达GFP-MIM,GFP及MIM的突变体;用转膜腔(Transwell chambers)观察细胞迁移;检测细胞内蛋白相互作用和蛋白质磷酸化用免疫沉淀和免疫杂交;Pull down法测定蛋白质在体外相互作用和结合力;免疫荧光染色观察细胞内蛋白共定位及细胞形态的变化;通过嵌二萘标记肌动蛋白的动态变化, 测定各种蛋白对肌动蛋白聚合的影响; 免疫荧光染色观察actin纤维的分枝和形态。 结果 (1) MIM在许多正常组织细胞中的表达水平明显高于恶性肿瘤细胞。(2)与过表达GFP细胞相比, MIM的过表达能显著抑制分别在血小板衍生生长因子(PDGF) ,神经鞘氨醇1磷酸盐(S1P) 或单核细胞化学趋化蛋白-1(MCP-1)诱导的3T3,HUVEC和HL-60细胞相对迁移率(3T3 细胞: 122±16.8 比196±21.4%, P<0.01; HUVEC: 148±22.3 比264±42.3%, P<0.01; HL-60细胞: 69±12.5 比(48±15.9%, P<0.01)。(3)PDGF刺激下, MIM快速发生酪氨酸磷酸化及短暂增强与cortactin(Arp2/3的激动剂)结合。(4) MIM和cortactin共定位于细胞的点状结构及细胞周边。(5) 全长MIM 通过PRD(Proline Rich Domain, 脯氨酸丰富区) 片段和cortactin的SH3片段与cortactin结合。(6)体外肌动蛋白聚合试验表明,全长MIM能显著促进cortactin和Arp2/3复合物介导的actin聚合和非分枝actin纤维形成 (32.4±2.1/field比20.2±2.3/field, P<0.001), 这种促进作用需要MIM的N-端序列及与cortactin连结。然而, 在同等条件下,MIM显著抑制N-WASP-VCA介导的actin聚合和actin分枝纤维形成(10.1±1.1% 比79.3±5.6%, P<0.01)。 (7)GFP-MIM促进3T3细胞形成丝状假足(filopodia)(典型丝状假足细胞百分比:46±3.8% 比16±2.3%, <WP=6>P<0.01)。(8)有趣的是过量表达MIMΔWH2促进细胞迁移, 而过量表达MIMΔPRD则进一步抑制PDGF刺激的细胞运动。 结论 本研究提示了细胞迁移的一种崭新机制: MIM 对不同Arp2/3复合物激活物的不同调节, 在细胞迁移中发挥独特作用。