目的抗生素的滥用导致了多重耐药细菌和泛耐药细菌的大量出现和蔓延,已成为危害人类健康的严重灾难,也是当前公共卫生领域各国政府高度关注的焦点。由于抗生素在应用过程中会不可避免地诱导细菌耐药,新抗生素用于临床后细菌很快就会产生耐药,因此传统抗生素的研制并不能从根本上解决细菌耐药问题。而且抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了新抗生素研发的速度,临床有效的抗菌药物日趋减少。因此,研发不易诱导耐药新型抗菌药物是抗感染药物研究领域当务之急的研究目标。细菌群体感应系统（quorum sensing system,QSS）在细菌毒力因子表达调控、耐药性产生、生物膜形成、休眠体形成和免疫逃逸等方面发挥至关重要的作用。阻断细菌QSS可以抑制其毒力和致病力,而不直接影响细菌的生长或活力,细菌不会受到较强的选择性生存压力,因此不易导致耐药性的快速产生。因此,以QSS为靶点的群体感应抑制剂（quorum sensing inhibitor,QSI）的研究倍受重视,成为新型抗菌药物研发领域的新方向。Qse C是广泛存在于革兰氏阴性细菌表面的群体感应系统,至少25种重要致病细菌表达Qse C,这些Qse C具有较高同源性,参与调控细菌毒力、侵袭力和致病性。Rasko等通过对化合物库进行高通量筛选,首次获得了一种选择性作用于Qse C的抑制剂LED209,并证实LED209在体外能抑制细菌毒力基因表达,体内能显著降低感染鼠伤寒沙门氏菌或土拉热弗朗西丝菌的小鼠的死亡率和脏器荷菌量。然而,目前所知包括LED209在内的所有群体感应抑制剂在体外均无杀菌和抑菌作用,但在感染动物体内却能发挥有效的抗感染保护效应,迄今为止,这一现象的内在规律和作用机理几乎完全不清楚。我们前期的研究显示,阻断细菌QSS可以调控感染小鼠体内多种细胞因子的分泌水平,提示机体天然免疫系统可能参与了QSI的抗感染保护效应。因此,我们推测Qse C抑制剂LED209进入机体后,很可能通过某种机制启动了机体天然免疫抗菌应答效应,继而杀灭和清除体内细菌。本课题针对上述未知问题和我们的推测,选择临床感染较为常见、耐药率高的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium,S.Typhimurium）作为研究对象,构建Qse C群体感应系统缺失的qse C敲除株,并利用Qse C特异性抑制剂LED209作为工具药,揭示阻断鼠伤寒沙门氏菌Qse C,或者敲除qse C基因后,何种免疫细胞参与体内抗感染保护效应,探索免疫细胞与抗感染保护效应的内在联系和分子机理。方法1.构建鼠伤寒沙门氏菌qse C基因敲除株△qse C采用RED同源重组技术,根据鼠伤寒沙门氏菌qse C基因（Gen Bank Number:NC₀03197.2）的上下游序列和质粒p KD3的氯霉素抗性序列（Cm）,设计三对特异性引物,分别用于扩增qse C基因上下游同源臂和氯霉素抗性片段。通过融合PCR实验,将三个片段连接为线性打靶DNA。将线性打靶DNA电转入含有p KD46质粒的鼠伤寒沙门氏菌感受态,筛选氯霉素阳性单克隆,即为qse C基因替换为氯霉素抗性的菌株。最后通过p CP20表达FLP重组酶,删除FRT位点间的氯霉素抗性序列,即可得到无抗性的鼠伤寒沙门氏菌qse C敲除株△qse C。2.LED209对体外培养鼠伤寒沙门氏菌生长的影响采用微量稀释法检测LED209对鼠伤寒沙门氏菌的最低抑菌浓度（MIC）。用全自动生长曲线分析仪测定细菌培养液的吸光度（OD600）,观察LED209在5 n M、500n M和50μM浓度范围内,以及敲除qse C基因后对细菌生长的影响,以左氧氟沙星作为阳性对照抗生素,绘制细菌生长曲线。3.LED209对鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的保护作用BALB/c小鼠随机分为野生型鼠伤寒沙门氏菌感染组（WT）、qse C敲除株感染组（Δqes C）和LED209处理组。分别给小鼠腹腔注射WT或Δqes C菌液1.0×108 CFU,构建小鼠脓毒症模型。LED209处理组分别于感染前、感染后3小时灌胃给予LED20920 mg/kg。记录上述各组小鼠感染后48小时内生存情况,绘制生存曲线。于感染后20小时,取部分肝脏、脾脏匀浆后涂布于琼脂平板,计数细菌CFU。制备感染小鼠肝脏、脾脏病理切片,HE染色后评价各组感染小鼠脏器病理损伤。分离感染小鼠肝脏、脾脏中的鼠伤寒沙门氏菌,使用荧光定量PCR法检测其重要毒力因子的m RNA表达水平。4.清除小鼠体内巨噬细胞对LED209体内抗感染作用的影响仿文献给予BALB/c小鼠腹腔注射200μL浓度为5 mg/m L的氯膦酸二钠脂质体（clodronate-liposomes）,清除小鼠体内巨噬细胞。在注射后24小时进行感染,记录各组小鼠感染后48小时内生存情况,计数感染后20小时小鼠肝脏、脾脏内细菌CFU,评价清除巨噬细胞后对LED209小鼠体内抗感染效果的影响。5.阻断Qse C系统调控巨噬抗菌应答效应的机理5.1仿文献分离BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞,建立巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌体外共培养模型。感染后1小时,拍照记录感染后巨噬细胞形态,并收集巨噬细胞培养上清,进行LDH检测,计算巨噬细胞死亡率。受感染巨噬细胞进行DAPI和PI双染,计算PI阳性细胞的百分率以评价巨噬细胞膜完整性和死亡率。5.2使用RIPK1特异性抑制剂Nec-1或caspase-1特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk预处理巨噬细胞后进行感染,感染后1小时收集细胞上清检测LDH释放量,计算巨噬细胞死亡率。5.3巨噬细胞感染后指定时间点,提取上清蛋白检测caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平,并使用ELISA检测上清IL-1β的释放量,评价阻断Qse C对感染后巨噬细胞炎性复合体活化的影响。5.4鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠后8小时,收集小鼠血清和腹腔灌流液,ELISA检测IL-1β的分泌量。获取感染后小鼠腹腔细胞,使用PI和F4/80抗体标记后进行流式细胞仪分析,计算双阳性细胞百分率,评价感染后小鼠腹腔巨噬细胞的焦亡率。提取感染后小鼠腹腔巨噬细胞总蛋白,检测caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平,评价阻断Qse C对感染后体内巨噬细胞炎性复合体活化的影响。5.5使用si RNA沉默巨噬细胞NLRP3和NLRC4炎性复合体后进行感染,1小时后收集细胞上清检测LDH含量,计算巨噬细胞焦亡率。使用DAPI和PI双染后计算PI阳性细胞的百分率。western blotting检测沉默NLRC4炎性复合体后受感染巨噬细胞caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平,ELISA检测上清中IL-1β的释放量。5.6鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞后1、8和16小时,使用1%Trition X-100裂解细胞,裂解液梯度稀释后涂布琼脂平板计数胞内存活细菌的CFU。5.7鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞后8小时,实时定量PCR检测NADPH氧化酶和i NOS的表达水平。收集细胞培养上清,检测过氧化氢和一氧化氮的含量。评价阻断Qse C对感染后巨噬细胞活性氧和活性氮表达及合成的影响。5.8使用i NOS抑制剂L-NMMA和NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理巨噬细胞后进行感染,计数胞内细菌CFU,评价阻断Qse C后对巨噬细胞活性氧和活性氮杀菌能力的影响。5.9于LB培养基中加入过氧化氢或亚硝酸钠,每2小时取菌液梯度稀释后涂布琼脂平板,计数细菌CFU,评价阻断Qse C后细菌对活性氧和活性氮杀伤的敏感性。5.10氯喹抵抗实验:氯喹处理细胞后,会在SCV中积累并最终杀死SCV中的细菌。通过比较氯喹处理与否的胞内细菌CFU,评价阻断Qse C对于细菌SCV的影响。5.11溶酶体转运实验:用生物素标记细菌,预先使亲和素标记的辣根过氧化物酶转运到巨噬细胞溶酶体,通过检测吸光度评价溶酶体与细菌的融合能力。5.12给予感染小鼠腹腔注射caspase-1特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk或活性氧活性氮抑制剂DPI,记录感染小鼠生存率和生存时间,计数感染小鼠肝脏、脾脏细菌CFU。结果1.成功构建鼠伤寒沙门氏菌qseC敲除株△qseC通过RED同源重组技术构建鼠伤寒沙门氏菌qse C基因敲除株△qse C,经PCR鉴定及测序鉴定,确证鼠伤寒沙门氏菌qse C基因已被成功敲除。2.LED209不影响体外培养细菌的生长MIC结果显示,256μg/m L的LED209未表现出抑菌或杀菌作用。LED209在5 n M⁵0μM浓度范围内对细菌生长曲线无明显影响。qse C缺失菌株的生长情况与野生型菌株也无显著差异。表明阻断鼠伤寒沙门氏菌Qse C或者敲除其qse C基因,均对细菌生长无明显影响。3.LED209在感染小鼠体内能够发挥抗感染保护效应WT鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠在48小时内全部死亡,而LED209处理组感染后48小时仍有50%小鼠存活,Δqes C菌株感染小鼠在感染后48小时全部存活。与WT菌感染组相比,LED209处理组和Δqes C菌株感染组小鼠肝脏、脾脏细菌菌落数显著减少,且脏器病理损伤显著减轻。实时定量PCR结果显示,LED209处理组和Δqes C菌株在感染小鼠体内致病相关毒力因子flh DC、sif A和sop B的表达显著降低。上述结果确证,LED209在体内能够发挥有效的抗感染作用。4.巨噬细胞参与介导了LED209体内抗感染保护效应为了明确LED209体内抗感染保护效应与何种免疫细胞相关,我们先用氯膦酸脂质体清除小鼠体内巨噬细胞,然后进行感染。结果显示,LED209体内抗感染保护效应显著减弱,小鼠存活率由50%降低至10%,Δqes C菌株感染小鼠的存活率则由100%降低至30%,肝脏、脾脏荷菌量显著升高。上述结果表明,巨噬细胞参与介导了LED209体内抗感染保护效应。5.LED209能够抑制鼠伤寒沙门氏菌感染所致的巨噬细胞死亡在巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌体外共培养模型上观察发现,WT菌株感染后1小时,大量巨噬细胞发生肿胀、破膜和死亡,而LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞形态完好,与未感染对照组无明显差异。LDH检测结果显示,在WT菌株感染后1小时,60%以上受感染感染巨噬细胞发生死亡,而LED209处理组和Δqes C菌株感染组仅有10%的巨噬细胞发生死亡。DAPI和PI双染结果显示,WT菌株感染后1小时,巨噬细胞PI阳性百分率显著升高,而LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞PI阳性百分率显著低于WT菌株感染组。以上结果表明,LED209阻断Qse C能够显著抑制鼠伤寒沙门氏菌感染诱导巨噬细胞死亡的效应。6.鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的巨噬细胞死亡属焦亡,LED209可抑制受感染巨噬细胞焦亡的发生近期研究发现,鼠伤寒沙门氏菌感染可以诱导巨噬细胞发生坏死性凋亡和焦亡。坏死性凋亡可以被RIPK1特异性抑制剂necrostatin-1（Nec-1）阻断;焦亡则可以被caspase-1特异性抑制剂Ac-YVAD-cmk阻断。分别用Nec-1或Ac-YVAD-cmk预处理巨噬细胞,然后用细菌感染细胞,感染后1小时收集细胞上清检测LDH释放量。结果显示,Ac-YVAD-cmk预处理则可以显著抑制鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的巨噬细胞死亡。表明鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的巨噬细胞死亡方式为焦亡,LED209阻断Qse C能够抑制鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的巨噬细胞焦亡。7.鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的巨噬细胞快速焦亡由NLRC4炎性复合体介导,LED209阻断细菌Qse C能够抑制NLRC4-caspase-1-IL-1β信号通路活化,继而抑制巨噬细胞发生焦亡进一步探讨阻断细菌Qse C如何抑制受感染巨噬细胞发生焦亡,在体外细菌和巨噬细胞共培养模型以及脓毒症模型小鼠上观察炎性复合体信号通路的活化情况。体外结果显示,WT菌株感染组巨噬细胞caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平显著增加,分泌至上清中IL-1β的浓度显著升高,表明WT菌株感染诱导了巨噬细胞炎性复合体的激活。而LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平与未感染时相比无显著差异,培养液上清中的IL-1β浓度也无明显升高。体内结果显示,WT菌株感染组小鼠腹腔巨噬细胞焦亡率、腹腔巨噬细胞caspas-1和IL-1β活化形式的表达水平以及小鼠血清和腹腔灌流液中IL-1β的分泌量均显著高于LED209处理组和Δqes C菌株感染组小鼠。用si RNA分别沉默巨噬细胞NLRP3或NLRC4炎性复合体,然后以细菌感染细胞,检测培养上清中LDH释放量,并计算巨噬细胞焦亡率。结果显示,沉默NLRC4炎性复合体后,受感染巨噬细胞焦亡率和PI阳性百分率显著降低,caspase-1和IL-1β活化形式的表达水平显著降低,培养上清中IL-1β的浓度显著降低,表明NLRC4炎性复合体参与介导了感染诱导的巨噬细胞焦亡。进一步检测能够活化NLRC4的鼠伤寒沙门氏菌鞭毛基因flh DC的表达及其功能,结果显示,LED209阻断Qse C后鼠伤寒沙门氏菌flh DC基因表达水平显著降低,细菌鞭毛动力显著减弱。结果提示,LED209可能通过阻断Qse C,抑制鼠伤寒沙门氏菌鞭毛基因flh DC的表达,进而抑制NLRC4炎性复合体活化,最终抑制巨噬细胞的焦亡。8.LED209能够促进巨噬细胞内细菌的清除上述结果表明LED209通过阻断Qse C,进而抑制感染诱导的巨噬细胞焦亡,那么被巨噬细胞吞噬进入胞内的细菌命运又如何呢?研究结果显示,鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞后1小时,WT菌株感染组、LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞内细菌CFU无显著性差异,表明巨噬细胞对三组细菌的吞噬能力没有差异。感染后8和16小时,WT菌株感染组细胞内细菌的CFU呈现时间依赖性升高,表明细菌在巨噬细胞内持续增殖。而LED209处理组和Δqes C菌株感染组胞内细菌CFU在感染后8、16小时则表现为时间依赖性减少,表明LED209阻断Qse C或敲除qse C基因后,可以促进巨噬细胞对胞内细菌的清除。9.LED209能够增强细菌对活性氧和活性氮杀伤的敏感性进一步探讨阻断细菌Qse C或敲除qse C基因为何能促进巨噬细胞胞内杀菌,检测与巨噬细胞胞内杀菌相关的活性氧和活性氮相关酶的表达水平和含量变化。结果显示,巨噬细胞内NADPH氧化酶的三个重要亚基gp91phox、p22phox、p47phox以及i NOS的表达水平,上清中一氧化氮和过氧化氢的含量,在三个感染组间均无显著差异。表明阻断细菌Qse C或敲除qse C基因不影响感染后巨噬细胞活性氧和活性氮的合成。使用i NOS抑制剂L-NMMA和NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理巨噬细胞,然后对其进行感染,计数胞内细菌CFU。结果显示,DPI和L-NMMA预处理后,LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞胞内活菌数显著增多,表明巨噬细胞对阻断Qse C或敲除qes C的鼠伤寒沙门氏菌的清除能力降低。在LB培养基中加入外源性过氧化氢或亚硝酸钠,每2小时计数细菌CFU。结果显示,在过氧化氢或亚硝酸钠的作用下,WT组细菌的增殖被显著抑制,而LED209处理组和Δqes C组的活菌数与初始菌量相比出现下降趋势。上述结果表明,阻断Qse C或敲除qes C后,细菌对氧和活性氮杀伤的抵抗性显著降低,更容易被巨噬细胞杀死。10.LED209能够抑制巨噬细胞内沙门氏菌液泡的维持,促进胞内细菌与溶酶体融合氯喹抵抗实验结果显示,在感染早期（2-4小时）,巨噬细胞内三组细菌在胞质中的比例没有显著性差异。但在感染后6-8小时,LED209处理组和Δqes C菌株感染组巨噬细胞胞质中细菌的比例显著升高,提示阻断Qse C或敲除qse C后抑制胞内SCV的维持,使细菌更易从SCV转移至胞质中。为了探讨阻断Qse C或敲除qse C抑制胞内SCV维持的机理,我们检测了巨噬细胞内鼠伤寒沙门氏菌SCV维持相关基因sop B和sif A的表达水平。结果显示,阻断Qse C或敲除qse C后,细菌sop B和sif A的表达水平显著降低。以上结果提示,阻断Qse C或敲除qse C后,可能通过抑制sop B和sif A的表达水平,进而抑制巨噬细胞内细菌SCV的维持,抑制细菌逃逸胞内杀菌分子的杀伤。采用溶酶体转运实验评价溶酶体与细菌的融合能力。结果显示,WT菌株感染组细菌吸光度一直维持在较低水平,而LED209处理组和Δqes C菌株感染组的吸光度值在感染后显著升高。以上结果表明,WT细菌能够抑制溶酶体的融合,阻断Qse C或敲除qse C能够促进胞内细菌与溶酶体融合,利于巨噬细胞杀伤胞内细菌。11.在感染小鼠体内证实LED209的抗感染保护作用与抑制巨噬细胞焦亡和增进感染细菌对活性氧活性氮敏感性相关给予小鼠caspase-1抑制剂Ac-YVAD-cmk预处理后进行感染,记录感染小鼠生存率和生存时间。结果显示,Ac-YVAD-cmk处理后,WT菌株感染组小鼠生存时间显著延长,腹腔巨噬细胞焦亡率、caspas-1和IL-1β活化形式的表达水平以及血清IL-1β的释放量显著降低。提示Ac-YVAD-cmk处理通过抑制炎性复合体激活,进而抑制过度的炎症反应和巨噬细胞焦亡,延长小鼠生存时间。给予小鼠活性氧和活性氮抑制剂DPI预处理后进行感染,记录感染小鼠生存率,计数脏器CFU。结果显示,DPI处理后,LED209处理组和Δqes C菌株感染组小鼠生存率显著降低,且肝脏和脾脏荷菌量显著升高,表明DPI处理可以减弱LED209的体内抗感染保护效应,提示活性氧和活性氮参与了体内阻断Qse C和敲除qse C鼠伤寒沙门氏菌的清除。结论1.发现LED209的体内抗感染保护效应主要由巨噬细胞参与介导。2.发现LED209通过阻断鼠伤寒沙门氏菌Qse C,抑制其鞭毛蛋白基因flh DC的表达,进而抑制巨噬细胞NLRC4炎性复合体的活化和巨噬细胞焦亡的发生。3.发现LED209阻断鼠伤寒沙门氏菌Qse C可以促进巨噬细胞清除胞内细菌,该效应与抑制鼠伤寒沙门氏菌胞内SCV的维持,促进细菌由SCV向胞质转移,促进细菌与溶酶体融合,增加细菌对活性氧和活性氮杀伤的敏感性相关。