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研究背景逆向性痤疮（Inversa acne,AI）又名化脓性汗腺炎，是一种少见的常染色体显性遗传病，以反复发生皮肤脓肿、窦道及瘢痕形成为特征性表现。起初该病被认为与顶泌汗腺有关，直至1990年，Yu和Cook表明导致本病的始动因素是毛囊的闭塞。目前认为，该病是由于毛囊漏斗部的上皮细胞过度增生造成毛囊口及皮脂腺的阻塞，皮质排出不畅，激发细菌感染引起。遗传因素是最主要的病因，环境及内分泌等其它因素在该病的发病中也起着重要作用。AI通常好发于腋窝、腹股沟及臀部等大汗腺分布部位，初起为坚实的疼痛性炎性结节，以后可出现波动感、脓肿破裂、流脓和形成窦道。实验室检查往往发现贫血、血沉加快，血清类风湿因子阴性。AI常伴发聚合性痤疮和脓肿性穿凿性头部毛囊周围炎，统称为毛囊闭锁三联征；除皮损外，本病还可伴发关节炎或者继发鳞状上皮细胞癌，不仅对患者的健康和美观均有极大影响，而且可造成患者严重的身心负担。逆向性痤疮全球发病率为1-4%，一般发生于青春期后，大多数病例在20-30岁时发病，平均发病年龄为23岁。本病多发生于女性，女性与男性的发病比率为3.3:1.14。本病有家族性群发现象，可表现为常染色体显性遗传，亦可为散发。2006年,本实验室在一个四代中国汉族人家系中将该病的致病基因定位于染色体1p21.1—1q25.3区域，但是没有发现该病的致病基因。除此之外，染色体6q25.1—25.5和9p12—13.11也被提出与AI相关。Werth和Williams指出AI可能是一种异质性疾病，其发病可能与几个基因相关。目前，对单基因疾病致病基因的搜寻多采用定位克隆的方式，然而，该方法耗时较长且定位区域一般较大，往往不能直接找到疾病的致病基因。最近，全基因组外显子测序被成功地应用于发现稀有单基因疾病的致病基因，如Freeman–Sheldon综合症的MYH3基因，Miller综合征的DHODH基因和Schinzel-Giedion综合征的SETBP1基因。该方法已被证明为降低稀有单基因疾病候选基因甚至发现其致病基因的有力、有效手段。目的（1）通过全基因组外显子测序发现逆向性痤疮的候选致病基因。（2）通过对候选致病基因进行验证，明确逆向性痤疮的致病基因。（3）通过比较该致病基因在病例和对照之间表达水平的差异，探索其在逆向性痤疮发病机制中的作用。方法（1）为了更有效的筛选候选基因，选择之前通过全基因组连锁分析将逆向性痤疮的致病基因定位于染色体1p21.1—1q25.3区域的家系（家系I）进行初筛研究。对家系I的两名病例（Ⅱ4和Ⅲ11）和1名家系内对照（Ⅲ10）进行全基因组外显子测序。（2）通过a.过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变，只保留非同义突变、剪切位点突变等影响基因功能的突变；b.过滤掉公共遗传突变数据库（dbSNP）正常人携带的常见突变、已发表的正常对照个体的突变、以及该项目实验测序的正常对照个体的突变；然后在所有患病个体的突变集合中取交集；减少候选致病突变的数量。（3）通过候选致病区域染色体1p21.1—1q25.3过滤，进一步减少候选致病突变的数量，并利用软件预测突变对蛋白功能的影响进一步筛选，发现逆向性痤疮可能的致病突变/基因（4）用PCR测序方法，在初筛家系（家系I）中验证通过全基因组外显子测序发现的突变位点，观测该突变是否导致了疾病表型的发生。（5）通过PCR测序方法，在其他家系（家系Ⅱ）的患者中检验候选致病基因的所有外显子中是否发生功能性突变；之后，在更大范围的正常人群中验证在前两步中发现的存在于候选致病基因中的所有功能突变。（6）采用实时定量PCR的方法，从mRNA水平检测致病基因在逆向性痤疮患者和正常对照外周血单个核细胞中是否存在表达差异。结果（1）经过全基因组外显子测序后，初筛家系两名病例（Ⅱ4和Ⅲ11）和一名家系内对照（Ⅲ10）测到的总SNPs数分别为：41,177，44,660和42,196个。（2）过滤掉同义突变等不影响基因功能的突变和公共遗传突变数据库（dbSNP）正常人携带的常见突变、已发表的正常对照个体的突变、以及该项目实验测序的正常对照个体（Ⅲ10）的突变后，Ⅱ4和Ⅲ11所剩余的突变位点分别为：227和203个；随后，两名患者Ⅱ4和Ⅲ11的突变位点取交集，所剩余的突变位点为85个。（3）在候选区域染色体1p21.1—1q25.3内对上述85个突变位点进一步过滤，剩余的突变位点还有8个，分别位于以下8个基因内：MYBPHL, KCNC4, FLAD1, NES, NCSTN,ITLN2, SLC9A11和Clorf220。利用ANNOVAR和GERP等软件预测突变对蛋白功能的影响进一步筛选后，发现位于NCSTN基因的c.1352+1G>A剪切位点突变最有可能为初筛家系（家系I）的致病突变。（4）用PCR测序方法，对突变位点NCSTN c.1352+1G>A在家系I内进行验证，观测到该突变导致了家系I患者逆向性痤疮的发病。（5）通过PCR测序方法，在其他家系（家系Ⅱ）的患者中检测到候选致病基因NCSTN的第3号外显子存在一个2个核苷酸的缺失c.210211delAG。家系内所有对照均不存在该突变。前两步发现的存在于候选致病基因NCSTN中的两个功能突变于90名正常人中通过PCR测序方法验证后也不存在。（6）与正常人相比，NCSTN mRNA在逆向性痤疮患者外周血单个核细胞中的表达降低。结论本研究采用最先进的全基因组外显子测序方法，成功发现了逆向性痤疮的致病基因NCSTN，在此基础上，通过NCSTN mRNA表达研究表明γ-分泌酶亚单位基因NCSTN单倍剂量不足可能为家族性逆向性痤疮某种亚型的遗传学发病基础。而且，研究结果提示出γ-分泌酶—Notch通路可能参与了家族性逆向性痤疮的分子学发病机制。除此之外，本研究进一步证实了全基因组外显子测序为一种发现稀有单基因疾病致病基因有力、有效的方法。