论文部分内容阅读
油菜菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）引起的真菌性病害,每年导致油菜产量损失10%-20%,是制约我国油菜生产最主要的病害。培育抗（耐）病油菜品种是防治油菜菌核病最为经济有效的途径。在油菜及其近缘种中还没有发现对菌核病免疫的种质资源,数量抗性是目前油菜抗菌核病育种最重要的利用形式。本研究通过QTL定位、关联分析以及抗病和感病材料在接菌前后比较转录组分析,对甘蓝型油菜抗菌核病的遗传基础和分子机制进行了系统分析。主要研究结果如下:1.甘蓝型油菜菌核病抗性的QTL定位利用苗期离体叶片鉴定和成株期活体茎秆鉴定方法,对一个加倍单倍体群体（HJ-DH）进行了多年多环境下的抗性鉴定。发现叶片和茎秆抗性的广义遗传力分别为61.0%和68.3%。共定位到13个菌核病抗性QTL。两年的苗期叶片抗性鉴定共检测到3个QTL,分别位于A3、A9和C5连锁群上,其中在两年均鉴定到的主效QTL LRA9,可解释表型变异8.54%-15.86%;三个环境的成株期茎秆抗性鉴定共检测到10个QTL,分别位于A1、A2、A3、A6、A9、C2、C6、C7、C8连锁群上,鉴定到一个在所有环境稳定存在的主效QTL SRC6,可解释表型变异29.01%-32.61%,该QTL为目前甘蓝型油菜中所定位效应最大、最稳定的菌核病抗性QTL。2.通过比较作图和功能基因组方法鉴定主效QTL SRC6的候选基因以甘蓝基因组为媒介,将HJ-DH的C6连锁群和拟南芥进行比较作图分析,并通过对已发表的基因芯片表达谱数据的挖掘,锚定到SRC6的候选基因Bna C.IGMT5a。通过基因克隆、遗传定位、表达分析验证了该基因位于SRC6的置信区间,在抗性等位基因贡献亲本Hua 5中结构完整,接菌后24小时（hour post-inoculation,hpi）表达量显著上调,且在24-96 hpi表达量有不断上调的趋势。3.SRC6的精细定位利用连续回交方法构建了SRC6的近等基因系,并将其用于精细定位。分别在BC3F2及BC3F2:3代材料中验证了该QTL的效应,AA和aa两种基因型（QTL峰值处标记的基因型）的植株在7 dpi时病斑平均长度相差2.36 cm,最后通过QTL定位将其缩小至3.7 c M（对应物理距离700 kb）的范围内。4.甘蓝型油菜菌核病抗性的全基因组关联分析利用成株期离体茎秆鉴定法对448份甘蓝型油菜自交系进行连续两年的抗性鉴定,发现该群体抗性分离较大,茎秆抗性的广义遗传力为61.7%,鉴定到26份高抗材料。用60K SNP芯片对该群体进行基因分型后进行全基因组关联分析,共检测到与茎秆抗性显著关联的位点3个,DSRC4、DSRC6和DSRC8,都位于C基因组上,分别解释表型变异6.11%、5.61%和5.19%。检测到潜在的关联位点6个,p DSRA2、p DSRA3、p DSRA10、p DSRC5、p DSRC9a和p DSRC9b,解释表型变异3.57%-5.04%。这是甘蓝型油菜中菌核病抗性全基因组关联分析的首次报道。5.甘蓝型油菜抗菌核病QTL的整合利用甘蓝型油菜最新公布的参考基因组序列,将前人及本研究中得到的菌核病抗性QTL进行整合分析,将文献中93%的QTL定位到物理图谱上,这些QTL中62%定位于C基因组。共鉴定到5个抗性QTL的热点区域,包括A2的0-7.7 Mb,A3的0.8-6.8 Mb,A9的22.1-29.4 Mb,C2的0-6.7 Mb和C6的23.2-36.6 Mb。6.基于转录组测序进行甘蓝型油菜—核盘菌的互作分子机制解析以抗、感差异明显的两个甘蓝型油菜纯系J964（抗病,R-line）和J902（感病,S-line）为材料,在茎秆接种后的不同时间点（0、24、48、96 hpi）取样进行转录组测序。48 hpi时R-line与S-line相比差异基因数目更多而且差异表达倍数更高。利用相对差异表达基因（RDEG）参数,鉴定和比较了R-和S-line的差异表达基因,共鉴定到R-line相对S-line上调的RDEGs 5910个,相对下调的RDEGs 3091个。对这些RDEGs进行GO富集分析和所参与的防卫反应途径分析,发现一些类受体激酶（RLKs）基因,MAPK级联反应相关基因,WRKY转录因子,茉莉酸和乙烯的合成及信号转导途径相关的基因,吲哚类硫苷合成相关基因,以及防卫相关蛋白（PR2,PR3,PR4,PR5-like,PDF1.2b,几丁质酶,凝集素,β-1,3-葡聚糖酶和PGIP）合成相关基因等在R-line中诱导更加剧烈。并且发现防卫反应中随着信号的逐级传递,R-和S-line在基因表达变化上的差异越来越大。通过对R-和S-line在接种前后几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和PGIP等酶活性以及硫苷含量进行测定,发现R-line中三种的酶活性均比S-line中高,吲哚类硫苷含量在R-line中增加也更加剧烈。这些结果与转录组分析所得到的结果一致,表明R-和S-line的抗性差异与防卫反应的剧烈程度有关。同时,我们还发现在侵染早期（24 hpi前）R-和S-line之间产生的差异与物理屏障有关。R-line维管束发育更好、木质素含量更高、髓部失水更慢,从而在早期限制了核盘菌的成功侵染。另一方面,通过分析核盘菌在侵染两个材料时转录组的变化,我们鉴定到核盘菌的两大致病因子（细胞壁降解酶和草酸）合成相关的基因:多聚半乳糖醛酸内切酶基因（SS1G＿10167）、纤维二糖水解酶基因（SS1G＿09020）和草酰乙酸水解酶基因（SS1G＿08218）在核盘菌侵染过程中起到至关重要的作用。另外我们鉴定到了8个重要的候选effector基因可能也是核盘菌重要的致病因子。上述结果为深入理解甘蓝型油菜与核盘菌互作过程及油菜抗菌核病的分子机制提供了重要信息。