研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种潜在的致命性血管疾病,其定义为腹主动脉局部扩张,直径大于3cm或超过正常主动脉直径50%。AAA主要累及肾动脉分支以下的腹主动脉,患者通常没有症状,即使医生查体也难以触及扩张的腹主动脉,患者常由于其他临床指征行腹部超声或CT检查时偶然发现AAA,因此早期发现极为困难。一旦发生AAA破裂,死亡率高达85%-90%,几乎是不治之症。如何发现AAA的发病原因和快速膨胀因素并进行有效的抑制,是临床医学界面临的重大难题。尽管在AAA发病机制的研究领域已取得了巨大进展,但目前尚无有效的临床预测因子或药物治疗来降低AAA的发病风险或限制其进展。当男性和女性患者的AAA内径分别大于55mm和50mm时,可实施外科矫正术或血管内介入手术,术后存活率超过95%。因此,对于预防AAA破裂,手术矫正和支架介入是唯一有效的方法,但这些操作均有创伤性和并发症。大力研发可抑制AAA发生和发展的新药,已成为AAA研究领域中的当务之急。促红细胞生成素（EPO）由165个氨基酸和4条分子量为34kd的紧密球状结构的碳水化合物侧链组成。EPO对正常红细胞的产生至关重要,主要由胎儿肝脏及成年人肾脏合成。EPO主要通过刺激造血系统中的促红细胞生成素受体（EPOR）起到促进红细胞生成的作用。EPO可在缺氧时由肾小管间质细胞产生,通过促进红细胞生成和抑制红细胞祖细胞的凋亡而增加红细胞数量。此外,EPO潜在的造血外功能也备受关注。研究表明,EPO可由肾脏以外组织产生,且EPORs在红系祖细胞以外的其他组织中亦有广泛分布。肾脏以外产生的EPO是通过旁分泌/自分泌的途径而发挥作用,而非造血功能中的激素样作用。在创伤和炎症反应中,EPO及其受体表达明显增加,从而触发创伤组织和器官中的关键保护反应。EPO的组织保护作用已在多个动物的疾病模型中得到证实,包括局灶性脑缺血、栓塞性卒中、创伤性脑损伤、心肌缺血、急性肾损伤、肢体缺血、组织创伤等。临床研究表明,在严重创伤患者中给予EPO治疗可降低患者的死亡率。最近的研究发现,EPO可通过促进内皮细胞增殖迁移和基质金属蛋白酶2（MMP2）表达促进血管新生。接受腹主动脉腔内修复的AAA患者有三分之一患有贫血,其血红蛋白水平与AAA的大小呈独立负相关,但其机制并不明确。最近一项高脂血症小鼠中输注血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的实验研究发现,抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）减弱了 AAA的进展。众所周知,慢性贫血和HIF可增加EPO的生成,而最近的证据表明,Ang Ⅱ可直接刺激造血祖细胞的受体或间接调节EPO的基因表达来影响造血功能。有罕见病例报道,一位长期进行血液透析并应用重组人EPO治疗的患者,无明显原因地对重组人EPO产生了耐药性,并CT检测发现了 AAA。这些临床和实验研究强烈提示EPO和AAA之间可能存在着某种联系,主动脉壁新生血管的形成,也被称为血管新生,是实验和临床AAAs的病理标志。有证据表明,主动脉瘤管壁内的血管新生可能在动脉瘤的进展和破裂中起关键作用。在人动脉瘤组织中,尤其是在邻近破裂区域和被白细胞浸润的区域,血管新生更为普遍。抑制实验性AAA进展的药物,也会减少动脉壁血管新生。基质金属蛋白酶（MMPs）家族密切参与新血管形成的过程,并发挥关键的促血管生成作用,而MMPs与动脉管壁的降解和破裂有关。缺氧和炎症是刺激血管新生的两个关键因素。HIF-1α及其靶基因在人类和实验性AAAs中表达增加。抑制HIF-1a治疗可以阻止实验性AAA进展,并减轻管壁白细胞浸润、血管新生和MMPs的过度表达。炎症和免疫相关疾病与血管新生相关,因为大多数白细胞能够产生一系列促血管生成因子,如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（b-FGF）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）以及蛋白酶,如糜蛋白酶、胰蛋白酶、MMPs。有报道称肥大细胞特异性的糜蛋白酶和胰蛋白酶诱导内皮细胞（ECs）表达粘附分子和趋化因子,其利用趋化因子受体2（CCR2）作为募集趋化因子的受体,降解基质蛋白,促进血管新生,诱导平滑肌细胞凋亡。AAA发生和发展过程涉及了多种病理过程,比如血管新生、炎症浸润、氧化应激和平滑肌细胞凋亡等,在本研究中,我们提出如下科学假说,在ApoE-/-小鼠或野生型小鼠中,EPO可以剂量依赖性地导致AAA的发生,并且EPO通过促进血管新生,增加炎症浸润,诱导平滑肌凋亡,导致AAA的发生,为了验证这一假说,我们精心设计并进行了一系列的体内外实验。研究目的1.探讨EPO是否可在ApoE-/-小鼠和野生型小鼠中导致AAA的产生及其剂量效应;2.探讨EPO对小鼠AAA的影响是否受高脂喂养和高脂血症的影响;3.探讨EPO通过何种类型受体发挥作用对AAA产生影响;4.探讨EPO引起小鼠AAA的病理生理机制;5.探讨EPO对血管壁三种细胞（内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）的作用及其机制。6.探讨在AAA临床患者中,血清EPO与AAA的发生有无关联。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（2）雄性ApoE-/-小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO 2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠60只,全程给予普通饲料喂养,随机分为4组,每组15只;分别给予生理盐水、EPO2,500 IU/kg/day、EPO 5,000 IU/kg/day 和 EPO 10,000 IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（4）雌性APoE-/-小鼠30只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为2组,每组15只;雌性野生型小鼠30只,全程给予普通饲料喂养,随机分为2组,每组15只;分别给予生理盐水和EPO5,000IU/kg/day腹腔注射,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（5）雄性ApoE-/-小鼠45只,全程给予高脂饲料喂养,随机分为3组,每组15只;雄性野生型小鼠45只,全程给予普通饲料喂养,随机分为3组,每组15只;分别给予生理盐水、焦谷氨酸螺旋B表面肽（pHBSP）30 mg/kg/day和pHBSP 300mg/kg/day持续泵入,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。（6）雄性ApoE-/-小鼠或野生型小鼠各30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续泵入,实验组给予Ang Ⅱ（1.44mg/kg/day）持续泵入,全程给予高脂高胆固醇喂养或普通饲料喂养,期间每天观察小鼠有无死亡情况,记录死亡数量和原因,4周后小鼠给予安乐死。2.鼠尾血压测量应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。3.组织取材小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。4.血脂血常规、肝肾功检测检测各组小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮的水平;检测各组小鼠全血红细胞计数、血红蛋白含量和红细胞压积。5.血管组织全基因组测序分析接受EPO中剂量注射的ApoE-/-小鼠3只,正常对照组3只,取出其主动脉组织,加入RNAlater液氮速冻,送至北京诺禾致源生物科技有限公司进行RNA测序。6.病理学检测腹主动脉组织或肝肾组织制备石蜡切片,主要进行H&E染色、Verhoff弹力纤维染色和 Masson 染色。对 Endomucin、MMP2、MMP9、MT1-MMP、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α等指标进行免疫组织化学染色,对 CD68、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α、CD144 和 Ki67 等指标进行组织免疫双荧光染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2、MMP9、MT1-MMP、VEGF、TGF-β1、KDR、Tie2、CD68、ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白含量。8.明胶酶谱实验配制含1%明胶的SDS-PAGE凝胶,提取腹主动脉段血管组织蛋白和各种细胞总蛋白,并进行BCA蛋白浓度测定。使用明胶酶谱试剂盒检测MMP2和MMP9的蛋白酶活性。9.RNA 提取、mRNA 逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2-ΔΔCT计算出cDNA的相对表达水平。10.细胞培养和信号通路（1）根据EPO浓度梯度预实验,5 IU/mL EPO刺激HUVEC 24小时,所表达的MMP2和MMP9酶活性最高,因此接下来的细胞实验选用EPO 5 IU/mL刺激24小时,作为实验组条件;（2）HUVEC、HAEC、HASMC和巨噬细胞:实验组加入5IU/mLEPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（3）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的HASMC中,刺激24小时,收集细胞和上清;（4）HUVEC实验组加入5 IU/mL EPO,对照组加入等体积1x PBS,刺激24小时,收集上清;加入预先种好板的巨噬细胞中,分别刺激0、2、4、6、8和10小时,收集细胞和上清;（5）HUVEC实验组加入10mg/L pHBSP,对照组加入等体积1xPBS,刺激24小时,收集细胞和上清;（6）实验分为4组:对照组加入DMSO（作为溶剂对照）,EPO组加入EPO（5 IU/mL）+DMSO,JAK2 抑制剂组加入 EPO（5 IU/mL）+TG101348（1 μM）[49,50],STAT5 抑制剂组加入 EPO（5IU/mL）+CAS285986-31-4（50μg/mL）,刺激24小时,收集细胞或者观察拍照。11.EDU细胞增殖实验使用EDU试剂盒检测HUVEC或HASMC的增殖能力。12.内皮细胞迁移实验通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验,检测HUVEC和HAEC在EPO作用下的迁移能力。13.体外小管生成实验利用低生长因子Matrigel基质胶观察HUVEC和HAEC在EPO作用下体外小管生成能力。14.主动脉环出芽实验取野生型小鼠胸主动脉段,将血管剪成长约1mm的小段,置于Matrigel基质胶中,加入相应的药物刺激,每天观察拍照,软件分析计算主动脉出芽数量和长度。15.单核-内皮细胞粘附实验将HUVEC给予EPO刺激24小时;用BCECF-AM（pH荧光探针）标记THP-1细胞悬液;取1x105/mL THP-1混悬液加入到上述HUVEC细胞培养板中,孵育至少1小时;4%多聚甲醛固定细胞。16.TUNEL细胞凋亡检测给予HASMC EPO或者EPO处理过的HUVEC上清干预,使用TUNEL试剂盒检测HASMC的凋亡情况。17.腹腔巨噬细胞的提取选取8-12周雄性野生型小鼠,提前3天给予腹腔注射6%淀粉溶液1mL;小鼠脱颈处死,撕开皮肤,充分暴露腹膜;用无菌注射器注入DMEM于腹腔中,回抽液体至新的50mL离心管中;冲洗腹腔3次,直至DMEM变澄清,得到腹腔巨噬细胞混悬液。18.体内基质胶塞血管新生实验使用高浓度Matrigel基质胶,配制基质胶与药物混合液,取0.7mL基质胶混合液,注入小鼠皮下。14天后,切除基质胶塞;4%多聚甲醛固定过夜,观察基质胶塞大体形态颜色;石蜡包埋,切片,进行常规染色和免疫组化。19.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。20.腹主动脉瘤病人血清收集我们纳入40例AAA患者,在患者住院24小时内采集血样。患有贫血、心衰、慢性呼吸系统疾病和肾功能衰竭的病人排除入组。纳入45例健康志愿者的血清作为正常对照组。21.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;P<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO剂量依赖性地诱导ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生腹腔注射高中低剂量EPO4周后,发现EPO剂量依赖的增加了小鼠AAA的发生率,腹主动脉直径明显增加;同时,小鼠死亡率也呈剂量依赖性增加。EPO高剂量组诱导ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,而EPO高剂量组诱导野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ。2.EPO导致ApoE-/-小鼠和野生型小鼠腹主动脉管壁增厚弹力板断裂结果显示注射低中高剂量EPO后,动脉管壁明显增厚,弹力纤维断裂,管腔内可伴有血栓形成。3.EPO不影响ApoE-/-、鼠和野生型小鼠血压和血脂的变化EPO注射4周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组血压并无显著差异;同样,EPO注射后没有影响小鼠血脂水平变化。由此推断,EPO注射4周,对小鼠的血压和血脂无显著影响。4.EPO不影响ApoE-/-小鼠和野生型小鼠肝功和肾功的变化EPO注射四周后,与对照组相比,EPO低中高剂量组的指标没有明显变化;取对照组和EPO高剂量组小鼠的肝脏和肾脏进行H&E染色,组织形态亦没有明显差别。由此,从药物毒理学角度推测,EPO注射4周,并没有引起肝脏和肾脏的功能障碍。5.高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应在全程普通饲料喂养过程中,发现EPO剂量依赖的增加了 ApoE/-小鼠AAA的发生率,且与高脂喂养模型的发生率无显著差异;同时,高脂喂养与否,EPO高剂量组小鼠的死亡率无明显统计学意义。由此得出,高脂饮食不影响EPO对ApoE-/-小鼠AAA形成的剂量效应。6.EPO可诱导雌性ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的发生结果显示,在中剂量EPO刺激下雌性ApoE-/-小鼠和雌性野生型小鼠均有AAA发生,但都略低于雄性小鼠发生率,这符合人类AAA发病率中,男性高于女性的特征。7.pHBSP不能剂量依赖性的诱导小鼠AAA的发生结果显示pHBSP不能诱导两种基因型的小鼠发生AAA,因此推断EPO可能通过同源二聚体受体发挥作用,导致AAA。8.AAA患者血清EPO水平明显增高两组之间在年龄、性别、肾功能和药物治疗方面没有显著差异,但吸烟者在AAA组比正常对照组更常见。通过分析显示,年龄在>65岁和≤65岁之间、男性和女性之间、吸烟者和非吸烟者之间的腹主动脉直径没有显著差异,这表明在这组患者中,AAA直径不受传统动脉粥样硬化危险因素的影响。与健康对照组相比,AAA患者的血清EPO水平显著升高,这表明该组患者分泌了更多的EPO于循环血液中。9.基因测序分析EPO对ApoE-/-小鼠主动脉组织mRNA表达谱的影响基因本体论分析发现,两组间差异基因主要富集在血管形态发生、血管新生、细胞周期和迁移、炎症反应、白细胞浸润、和细胞外基质重塑中。10.血管新生和胶原代谢参与EPO诱导AAA的过程结果显示,与对照组相比,EPO组腹主动脉管壁胶原显著减少,尤其是胶原Ⅰ和胶原Ⅲ表达。MMPs蛋白表达和活性明显高于对照组。EPO组腹主动脉管壁微血管密度明显增加,VEGF、TGF-β1、KDR和Tie2蛋白表达明显增高。11.炎症反应参与EPO诱导AAA的过程结果显示,EPO组腹主动脉CD68阳性细胞浸润动脉壁的程度明显高于对照组。同时 ICAM-1、VCAM-1、IL-6、IL-1β、MCP-1 和 TNF-α 等炎症因子 mRNA水平和蛋白水平表达明显多于对照组。CD68阳性细胞来源的炎症因子明显增高。MSD检测发现,血清炎症因子水平也明显高于对照组小鼠。12.EPO对小鼠红细胞、白细胞和血小板数量的影响给予小鼠EPO注射4周后,结果显示与对照组相比,EPO组红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积明显增高。而白细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞计数、粒细胞计数和血小板计数在两组之间无显著性差别。13.三种细胞中内皮细胞EPOR mRNA表达水平最高与平滑肌细胞和巨噬细胞相比,内皮细胞的EPOR表达最高,提示EPO可能主要以内皮细胞为靶点发挥作用。14.EPO促进内皮细胞的增殖和迁移通过EDU实验可以观察到EPO促进HUVEC增殖。通过划痕实验和Transwell小室细胞迁移实验观察到EPO促进HUVEC和HAEC迁移。15.EPO促进内皮细胞体外小管形成和小鼠主动脉环出芽结果显示EPO组内皮细胞更容易形成闭合的管状结构。小鼠胸主动脉环种植于Matrigel基质胶中,在EPO刺激下,主动脉环比对照组更容易出芽,出芽的数量和出芽长度明显增加。16.EPO促进内皮细胞血管新生相关蛋白的表达结果显示,给予EPO刺激后HUVEC或HAEC的MMPs蛋白表达水平和活性明显高于对照组。EPO组细胞的KDR和Tie2表达明显增高。17.pHBSP不能促进HUVEC迁移、体外小管形成和MMPs的表达结果显示,对照组和pHBSP组细胞迁移数量无明显差别,形成小管数量和小管总长度无显著差异。给予pHBSP刺激后HUVEC的MMPs蛋白表达水平和酶活性与对照组无明显差别。18.EPO促进内皮-单核细胞间的粘附作用结果显示,与对照组相比,EPO组粘附的单核细胞数明显增多,由此得出,EPO能够促进内皮-单核细胞间的粘附作用。19.EPO对巨噬细胞炎症因子表达的影响直接给予EPO刺激,巨噬细胞炎症因子的表达无意义;溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果显示,IL-6、IL-1β和TNF-α在6小时明显增高,MCP-1在8小时明显增高,由此得出,内皮细胞参与是EPO诱导巨噬细胞炎症因子上调的关键环节。20.EPO对巨噬细胞MMPs表达的影响溶剂对照或EPO刺激巨噬细胞24小时后,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激巨噬细胞,结果发现,两组MMP2和MMP9的蛋白表达和酶活性依然没有明显差别。由此推断,EPO并不能影响巨噬细胞MMPs的表达。21.EPO对平滑肌细胞胶原蛋白、MMPs和凋亡相关蛋白表达的影响给予浓度梯度的EPO刺激HASMC后,其胶原Ⅰ、胶原Ⅲ、MMP2和MMP9表达没有明显变化。EPO组HASMC表达BCL2和BAX与对照组也没有明显差异。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激平滑肌细胞,结果显示,EPO组HASMC表达胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,而MMP2和MMP9蛋白表达和酶活性明显增加。EPO组表达抗凋亡蛋白BCL2明显少于对照组,而表达促凋亡蛋白BAX明显多于对照组。22.EPO对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响结果显示直接给予EPO刺激,诱导的HASMC增殖和凋亡的数量与对照组无明显差别。溶剂对照或EPO刺激HUVEC 24小时后,取细胞培养液来刺激HASMC,结果显示EPO组TUNEL 阳性细胞比例明显高于对照组,而EDU 阳性细胞比例明显低于对照组。23.EPO在体内水平促进血管新生和炎症浸润14天后从小鼠体内取出基质胶塞显示:混有溶剂对照的基质胶塞呈清晰的黄色,而含有EPO的基质胶塞呈红色,说明基质胶塞内形成了血管。EPO组侵袭的细胞和血管数量明显增多。EPO组CD144和Ki67阳性细胞数量明显高于对照组,说明EPO促进内皮细胞的增殖和迁移。并且EPO组切片CD68阳性细胞浸润程度和炎症因子表达明显高于对照组,这表明EPO促进炎症细胞入侵和炎症因子的表达。24.EPO通过JAK2/STAT5通路诱导血管新生结果显示,EPO明显增强了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,而JAK2抑制剂明显抑制了 JAK2和STAT5的磷酸化水平,STAT5抑制剂只抑制了 STAT5的磷酸化水平,并没有影响JAK2的磷酸化水平。加入JAK2抑制剂和STAT5抑制剂后明显抑制了内皮细胞闭合管状结构的形成。通过以上结果可知,EPO通过JAK2/STAT5通路促进内皮细胞形成新生血管。25.EPO诱导AAA形成和发展的机制通过以上体内体外实验,我们基本得出EPO诱导AAA形成和发展的机制为:EPO刺激血管内皮细胞,激活JAK2/STAT5通路,促进血管新生、基质金属蛋白分泌、平滑肌细胞凋亡,抑制平滑肌细胞合成胶原蛋白,增强炎性细胞聚集和炎症因子释放,导致AAA的形成和发展。实验结论1.EPO剂量依赖性地促进了 ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA的形成,EPO导致ApoE-/-小鼠AAA发生率与Ang Ⅱ相当,EPO导致野生型小鼠AAA发生率明显高于Ang Ⅱ;2.EPO是通过（EPOR）2同型二聚体发挥作用促进AAA的形成;3.EPO通过引起血管新生、炎症反应和胶原降解而导致AAA的形成;4.EPO通过内皮细胞的介导诱导巨噬细胞表达炎症因子,抑制HASMC胶原分泌,促进HASMC凋亡。研究背景在腹主动脉瘤（AAA）发生发展过程中,由于AAA常与主动脉壁严重动脉粥样硬化损伤相关,因此传统认为AAA是动脉粥样硬化的结果。但这一传统观点近年来受到越来越多的挑战。与不合并动脉粥样硬化性心血管疾病的人群相比,合并冠心病、周围血管疾病、颈动脉疾病、脑血管疾病的患者发生AAA的OR值分别为1.72、1.59、1.51和1.18。在6446例接受颈动脉、股动脉和腹主动脉超声检查的Troms0研究中,斑块负荷与AAA发生率之间无量效关系,提示动脉粥样硬化与AAA可能是伴随关系而非因果关系。糖尿病是动脉粥样硬化的重要危险因素,但却是AAA的保护性因素,在美国310万人AAA流行病学调查中,与非糖尿病患者相比,糖尿病患者发生AAA的OR值为0.75,提示糖尿病可使AAA风险减少25%。这一反常现象提示,动脉粥样硬化与AAA可能是两个互相独立的疾病。吸烟与AAA的发生有很强的临床联系。吸烟人群中AAA的患病率是终身不吸烟人群的四倍以上。一份比较慢性吸烟者罹患不同疾病的相对风险的报告显示,罹患AAA的风险比罹患冠状动脉疾病的风险高出三倍,比罹患脑血管疾病的风险高出近五倍。2011年在瑞典进行的26256例65岁以上老年男性超声检查结果表明,AAA的发病率已下降至2.2%,其主要原因可能是吸烟人群的减少,提示控制吸烟可能是一个预防AAA的有效策略。基于这些临床观察,慢性吸烟可能是AAA发生发展的最重要的环境危险因素。除了吸烟外,其他危险因素还包括男性、年龄、高血压、慢性阻塞性肺疾病、高脂血症和家族病史。动物模型是一种强有力的工具,可以提供AAA发生和发展机制的理解。目前,AngⅡ注射模型是最常用的AAA动物模型。在高脂喂养的ApoE-/-或LDLR-/-小鼠皮下埋置微量渗透泵,持续注射大剂量Ang Ⅱ,可导致AAA,因此目前有关AAA发生和发展的细胞和分子机制主要来自于这类模型的研究。已提出的AAA发病机制包括:氧化应激机制:AAA患者或小鼠模型中促氧化剂增多,而抗氧化剂减少,从而导致ROS水平的上升,氧化应激增加,刺激血管紧张素转换酶（ACE）表达,内源性Ang Ⅱ增多,炎症反应增强。肾素-血管紧张素激活机制:持续滴注AngⅡ首先导致腹主动脉的炎症反应,继之出现弹性蛋白降解、血管中层断裂和管腔扩张,这些作用通过AT1R所介导,使用ACEI、ARB和ACE2过表达等方法以减少Ang Ⅱ的产生和作用,均可减轻小鼠AAA病变。AMPKa2激活机制:尼古丁和Ang Ⅱ可通过激活细胞膜表面的G蛋白偶联受体增加胞内的活性氧水平,活性氧可激活AMPK,形成AMPKa2/AP-2o/MMP2级联反应,从而活化MMP2的基因转录,最终导致血管壁细胞外基质的降解加速,引发AAA。胶原代谢机制:炎性因子不仅通过刺激MMPs表达而增加细胞外间质的降解,而且使得胶原合成障碍,加速AAA的形成。由于AAA是一个病因不明、病程迁延、病变发展、治疗有限、预后险恶的多因素疾病,且所得出的干预靶点在临床试验中尚无成功的先例,因此,对于AAA发生和发展机制的研究,我们仍处于早期阶段。Ang Ⅱ可以促进特定造血细胞系的増殖,而且Ang Ⅱ也参与了EPO在体内的调控。对健康志愿者的临床研究表明,Ang Ⅱ通过激活AT1R使血清EPO浓度升高约35%或更高。此外,在另一项对健康志愿者的研究中,ACEI类药物卡托普利和依那普利显著降低了血浆EPO水平,降幅高达20-30%。这些发现表明Ang Ⅱ在体内通过受体依赖信号调节EPO的产生,但EPO是否介导了Ang Ⅱ在体内的生物学作用,且引起AAA产生尚无报道。结合本研究论文I和论文Ⅱ的结论,EPO能够导致AAA的产生,因此我们假设在ApoE-/-小鼠中,EPO介导了Ang Ⅱ诱导的AAA的发生和发展,因此我们设计了一系列体内体外实验以验证此假说。研究目的1.探讨EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到的作用;2.探讨Ang Ⅱ诱导野生型小鼠AAA发生率较低的原因;3.探讨Ang Ⅱ作用于EPO的分子机制。研究方法1.动物模型的建立和分组（1）雄性ApoE-/-小鼠60只,随机分为4组:其中对照组给予生理盐水持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ组给予Ang Ⅱ持续泵入+生理盐水尾静脉注射,Ang Ⅱ+IgG2a组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO尾静脉注射,Ang Ⅱ+EPO中和抗体组给予Ang Ⅱ持续泵入+EPO中和抗体尾静脉注射,4周后小鼠给予安乐死。（2）实验组为EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠,对照组为同窝ApoE-/-小鼠,同时给予Ang Ⅱ持续栗入,4周后小鼠给予安乐死。（3）雄性野生型小鼠30只,随机分为两组,每组15只;对照组给予生理盐水持续栗入,实验组给予Ang Ⅱ持续泵入,全程给予普通饲料喂养,4周后小鼠给予安乐死。2.细胞培养和分组（1）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang Ⅱ+替米沙坦（lμM）组,AngII+PD123319（50μM）组,刺激12小时,收集细胞;（2）实验分为四组:对照组（溶剂对照）,Ang Ⅱ（50μM）组,Ang 11+替米沙坦（lμM）组,AngII+U0126（50μM）组,刺激12小时,收集细胞。3.鼠尾血压测量在给予药物干预4周末,应用小动物鼠尾血压计测量所有小鼠的血压,测量部位为小鼠尾动脉,每只小鼠检测3次,取其平均值作为最终数值。4.组织取材步骤小鼠取材前饥饿6-8小时,麻醉小鼠后取材,留取全血、血清、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脂肪组织和主动脉;各组织一部分放入液氮速冻,-80℃冰箱保存,一部分置于4%多聚甲醛中固定,以备后续实验。5.血常规检测使用兽用全自动血液细胞分析仪检测各组小鼠全血红细胞计数,血红蛋白含量和红细胞压积。6.免疫组织化学染色腹主动脉组织制备石蜡切片,对IL-6、IL-lβ、MCP-1和TNF-α进行免疫组织化学染色。7.蛋白免疫印迹实验提取腹主动脉段血管姐织蛋白和各种细胞总蛋白,进行BCA蛋白浓度测定。配制SDS-PAGE凝胶,通过蛋白免疫印迹检测EPO、EPOR、ERK1/2的蛋白含量。8.RNA提取、mRNA逆转录、RT-PCR提取腹主动脉段血管组织RNA和各种细胞总RNA,应用TaKaRa#RR047A逆转录试剂盒进行mRNA逆转录。通过实时荧光定量PCR,得出循环阈值Ct值,通过公式2^-△△CT计算出cDNA的相对表达水平。9.酶联免疫吸附实验使用ELISA方法检测血清中EPO的水平。10.数据统计分析所有数据均以均数±标准误来表示,两组计量资料采用独立样本t检验,多组计量资料采用单因素方差分析LSD事后检验;不符合正态分布的数据采用秩和检验;计数资料采用卡方检验;生存分析采用Log-Rank检验;户<0.05认为有统计学差异。研究结果1.EPO在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用结果显示,Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组AAA发生率明显增高;Ang Ⅱ组和Ang Ⅱ+IgG2a组之间无显著性差异,而Ang Ⅱ+EP0中和抗体组AAA发生率降为20%。Ang Ⅱ+EP0中和抗体组腹主动脉直径明显降低,死亡率明显下降。2.EPOR在Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠发生AAA的过程中起到重要作用由于EPOR-/-纯合小鼠致死,故我们只能获得EPOR+/-杂合小鼠。给予Ang Ⅱ埋泵4周后,结果显示与ApoE+小鼠组相比,EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组AAA发生率明显降低,且腹主动脉直径明显降低,死亡率降低至0。3.EPOR敲除抑制Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠AAA中炎症因子的表达EPOR+/-ApoE-/-双敲小鼠组腹主动脉管壁IL-6、IL-lp、MCP-1、TNF-a的表达明显少于ApoE-/-小鼠组。4.各组小鼠血清EPO水平比较ApoE-/-小鼠和野生型小鼠给予Ang Ⅱ千预后,Ang Ⅱ组的血清EPO水平比对照组高出2倍以上。同样给予Ang Ⅱ干预的ApoE-/-小鼠的血清EPO水平显著高于野生型小鼠的血清EPO水平。在野生型小鼠中,EPO注射组导致的血清EPO水平远高于Ang Ⅱ干预组。在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-小鼠和野生型小鼠AAA发病机制中EPO起了至关重要的作用。5.EPO介导了Ang Ⅱ诱导ApoE-/-小鼠的脾肿大和造血增加解剖小鼠后发现,与对照组相比,Angll组小鼠有明显的脾肿大现象,且脾脏重量明显高于对照组。EPO中和抗体治疗后,脾脏的大小和重量明显减少,且可显著抑制Ang Ⅱ诱导的RBC、HGB和HCT的增加。而EPOR+/-ApoE-/-小鼠与ApoE-/-小鼠相比,经Ang Ⅱ干预后造血表型无明显改变。6.Ang Ⅱ上调EPO表达的机制与对照组相比,Ang Ⅱ组表达EPO水平明显增高,Ang 11+替米沙坦组表达EPO水平显著低于Ang Ⅱ组,Ang Ⅱ+PD123319组表达EPO水平与Ang Ⅱ组无明显差异。Ang Ⅱ+U0126组表达EPO含量明显低于Ang Ⅱ组。Ang Ⅱ对786-0和HASMC有同样的作用。实验结论1.EPO/EPOR信号通路在Ang Ⅱ诱导AAA过程中起到关键性作用;2.血清EPO水平在Ang Ⅱ和EPO诱导的ApoE-/-和野生型小鼠AAA发病机制中起到关键作用;3.Ang Ⅱ通过AT1R/ERK1/2通路上调肾脏细胞和平滑肌细胞EPO表达,分别增加循环EPO水平和局部组织EPO水平。