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目的:研究姜黄素对人单核细胞白血病细胞(human acute monocytic leukemiacell line,THP-1)源性巨噬细胞胆固醇逆转运相关蛋白的表达,胆固醇外流和肿瘤坏死因-α(tumornecrosis factor,TNF-α)、单核细胞趋化因子-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)分泌的影响,深究其可能存在的机制,为姜黄素抗动脉粥样硬化(Artherosclerosis,AS)提供可靠理论基础,进一步为姜黄素预防和治疗心血管疾病提供一定的实验依据。方法:本实验以体外培养的THP-1细胞为研究对象,用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导生成巨噬细胞,按照以下方法进行实验1姜黄素毒性检测以不同终浓度(0-80 μM)的姜黄素与THP-1巨噬细胞孵育24h,细胞计数试剂盒(CellCountingKit-8,CCK-8)检测细胞活性。2姜黄素对THP-1巨噬细胞miR33a、TLR4、ABCA1的表达和胞内脂质含量,泡沫细胞形成率,IL-6、TNF-α和MCP-1分泌的影响实验分组:(1)空白对照组;(2)氧化型低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,ox-LDL)(50 μg/mL)组;(3)ox-LDL+ 姜黄素(40 μM)组;油红O染色处理细胞,光镜下观察细胞形态,计算泡沫细胞形成率,酶法测量胞内脂质含量,计算胞内胆固醇酯(cholesterol ester,CE)与总胆固醇(total cholesterol,TC)之比(CE/TC),实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time qPCR,RT-qPCR)测定 ATP 结合盒转运体 A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、微型 RNA(MicroRNA,miRNA)33a、Toll 样受体(Toll-like receptor,TLR)4 mRNA的表达,蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测ABCA1、TLR4蛋白含量,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒测定 IL-6、TNF-α和 MCP-1 的含量。3不同浓度和不同作用时间的姜黄素对THP-1巨噬细胞胆固醇流出率的影响ox-LDL诱导THP-1源性巨噬细胞吸收脂质,与不同浓度(0-40μM)或不同作用时间(6-24 h)条件的姜黄素共孵育,胆固醇荧光标记测定胆固醇流出率。4脂质体转染检测实验分组:(1)空白对照组;(2)泡沫细胞模型组;(3)ox-LDL+miR33a inhibitor 组;(4)ox-LDL+control sequence 组;使用提前设计的miR33a inhibitor和control sequence以脂质体转染法将其转染入THP-1巨噬细胞,RT-qPCR测定miR33a的表达。5姜黄素通过miR33a影响ABCA1表达,胆固醇流出率,IL-6、TNF-αMCP-1 的分泌实验分组:(1)空白对照组;(2)泡沫细胞模型组;(3)ox-LDL+姜黄素组;(4)ox-LDL+miR33 inhibitor组;(5)ox-LDL+姜黄素+miR33a inhibitor 组;(6)ox-LDL+control sequence 组;(7)ox-LDL+姜黄素+control sequence 组;RT-qPCR 测定 ABCA1 mRNA 的表达,Western Blot 测定 ABCA1 蛋白含量,荧光标记法检测胆固醇流出率,ELIS A试剂盒测定IL-6、TNF-αMCP-1的含量。6姜黄素对NF-κB/miR33a通路的影响实验分组:(1)空白对照组;(2)泡沫细胞模型组;(3)ox-LDL+姜黄素;(4)ox-LDL+NF-κB抑制剂PDTC组;RT-qPCR检测miR33amRNA的表达,Western Blot检测胞核内核转录因子 kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表达、胞浆内 NF-κB 抑制剂α(NF-κB inhibitor alpha,IκBα)和磷酸化 IκBα(phosphorylation IκBα,p-IκBα)的表达。7姜黄素通过NF-κB/miR33a通路影响ABCA1表达,胆固醇流出率以及IL-6、TNF-α、MCP-1 的分泌实验分组:(1)空白对照组;(2)泡沫细胞模型组;(3)ox-LDL+姜黄素组;(4)ox-LDL+miR3 3 a inhibitor组;(5)ox-LDL+PDTC 组;(6)ox-LDL+姜黄素+miR33a inhibitor 组;(7)ox-LDL+姜黄素+PDTC组;(8)ox-LDL+ control sequence 组;RT-qPCR 测定 ABCA1 mRNA 的表达,Western Blot 测定 ABCA1 蛋白含量,荧光标记法检测胆固醇流出率,ELISA试剂盒测定IL-6、TNF-α和MCP-1的含量。8姜黄素通过TLR4/NF-KB/miR33a通路影响ABCA1表达,胆固醇流出率以及IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌实验分组:(1)空白对照组;(2)泡沫细胞模型组;(3)ox-LDL+姜黄素组;(4)ox-LDL+TLR4抗体组;(5)ox-LDL+姜黄素+TLR4抗体组;(6)ox-LDL+TLR4同源非特异抗体组;(7)ox-LDL+姜黄素+TLR4同源非特异抗体组;RT-qPCR 检测 miR33a 和 ABCA1 mRNA 的表达,Western Blot 检测ABCA1蛋白含量和胞核内NF-κB p65、胞浆内IKBα和p-IκBα的含量,荧光标记法检测胆固醇流出率,ELISA试剂盒测定IL-6、TNF-α和MCP-1的含量。结果:1姜黄素毒性检测与空白对照组相比,在0-40 μM浓度范围内,姜黄素对细胞活性无显著影响(P>0.05),而在80 μM浓度时,姜黄素引起细胞活性下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。2姜黄素增加THP-1巨噬ABCA1的表达,抑制miR33a,TLR4的表达和IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌,降低胞内脂质含量和泡沫细胞形成率与空白对照组相比,ox-LDL组胞内脂质大量集聚,泡沫细胞形成率增高,脂质含量增加,CE/TC高达65.09±1.30,miR33a和TLR4表达增高,IL-6、TNF-α和MCP-1分泌增加,ABCA1表达下降。与ox-LDL组比较,ox-LDL+姜黄素组胞内脂质含量降低,miR33a和TLR4表达下降,IL-6、TNF-α和MCP-1分泌减少,ABCA1表达增高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3 THP-1巨噬细胞胆固醇流出率与姜黄素浓度或作用时间成正相关与泡沫细胞模型组相比,10-40 μM浓度和6-24h作用时间的姜黄素能显著增加胆固醇流出率,且流出率与姜黄素浓度和作用时间正相关,差异具有统计学意义(P<0.05),而ox-LDL+5μM姜黄素组与模型组之间无显著差异(P>0.05),48h与24h作用时间组无显著差异(P>0.05)。4脂质体转染检测与空白对照组相比,泡沫细胞模型组miR33amRNA的表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与泡沫细胞模型组相比,ox-LDL+miR33a inhibitor组miR33amRNA的表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05),而 ox-LDL+control sequence 组与模型组无显著差异(P>0.05)。5姜黄素通过抑制miR33a增加ABCA1表达,胆固醇流出率,降低IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌与空白对照组相比,泡沫细胞模型组ABCA1的表达明显降低,IL-6、TNF-α和MCP-1分泌增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与泡沫细胞模型组相比,ox-LDL+姜黄素组和ox-LDL+miR33a inhibitor组ABCA1的表达和胆固醇流出率显著增加,IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌减少,差异具有统计学意义(P<0.05),而ox-LDL+control sequence组与泡沫细胞模型组无显著差异(P>0.05)。6姜黄素抑制NF-κB/miR33a通路与空白对照组相比,泡沫细胞模型组miR33a的表达明显增加,胞核内NF-κB p65和胞浆p-IκBα的表达增加,胞浆内IκBα的表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与泡沫细胞模型组相比,ox-LDL+姜黄素组和ox-LDL+NF-κB阻断剂PDTC组miR33a的表达均显著降低,胞核内NF-κB p65和胞浆p-IκBα的表达减少,胞浆内IκBα的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。7姜黄素通过抑制NF-KB/miR33a通路增加ABCA1表达,胆固醇流出率,降低IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌与空白对照组相比,泡沫细胞模型组ABCA1的表达明显降低,IL-6、TNF-α、MCP-1分泌增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与泡沫细胞模型组相比,ox-LDL+ 姜黄素组、ox-LDL+PDTC 组、ox-LDL+miR33a inhibitor组ABCA1的表达和胆固醇流出率显著增加,IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而ox-LDL+control sequence组与泡沫细胞模型组无显著差异(P>0.05)。8姜黄素通过抑制TLR4/NF-KB/miR33a通路增加ABCA1表达和胆固醇流出率,降低IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌与空白对照组相比,泡沫细胞模型组miR33a的表达增加,胞核内NF-κB p65和胞浆内p-IKBα的蛋白量增加,胞浆内IκBα的蛋白量下降,ABCA1的表达下降,IL-6、TNF-α、MCP-1分泌增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。与泡沫细胞模型组相比,ox-LDL+姜黄素组、ox-LDL+TLR4抗体组miR33a的表达均显著降低,胞核内NF-κB p65和胞浆内p-IκBα的蛋白量下降,胞浆内IκBα的蛋白量增高,ABCA1的表达和胆固醇流出率上升,IL-6、TNF-α、MCP-1的分泌降低,差异具有统计学意义(P<0.05),而ox-LDL+TLR4同源非特异抗体组与泡沫细胞模型组无显著差异(P>0.05)。结论:1在0-40 μM的浓度范围内,姜黄素对THP-1巨噬细胞无毒性;2姜黄素在适当的浓度范围(10-40 μM)和作用时间(6-24h)内对胆固醇流出率呈浓度、时间依赖递增效应;3 TLR4/NF-κB/miR33a信号通路介导了 THP-1巨噬细胞胆固醇逆转运相关蛋白ABCA1的表达和胆固醇外流,参与调节IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌;4姜黄素可以通过TLR4/NF-κB/miR33a信号通路增加THP-1巨噬细胞胆固醇逆转运相关蛋白ABCA1的表达和胆固醇外流,降低IL-6、TNF-α和MCP-1的分泌。