背景与目的:急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）通常由胆道结构性梗阻、饮酒、内镜逆行胰胆管造影和药物引起,最终导致腺泡细胞死亡,诱发局部和全身炎症。大约15%-20%的患者会发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）。SAP过程中出现微循环损伤和低血容量,可引起肠黏膜缺血,继而再灌注损伤,导致肠屏障功能障碍和肠道菌群移位,而且肠黏膜屏障损伤导致的肠道细菌移位是引起胰腺感染坏死感染的关键环节。肠道菌群构成肠黏膜的生物屏障,可防御病原体感染,除肠道菌群本身,菌群代谢产物短链脂肪酸（Short chain fatty acids,SCFAs）,包括乙酸、丙酸、丁酸,可为肠上皮细胞提供能量,对肠黏膜屏障的正常生理功能及上皮完整性起重要保护作用。SCFAs可通过降低肠道p H值,增加粪便酸化,增加肠道菌群的生长和多样性。此外,SCFAs能促进一些有益细菌的增殖,如双歧杆菌（Bifidobacteria）和乳酸杆菌（Lactobacilli）。这些有益菌反过来刺激了短链脂肪酸的合成,降低肠道p H值,抑制病原菌定植,改善肠道微生物屏障功能,促进肠道内环境稳定。但是肠道菌群-SCFAs在SAP发生发展过程中肠黏膜屏障损伤的机制仍不清楚,因此从调节肠道菌群-SCFAs代谢失衡角度纠正肠黏膜屏障功能障碍减少肠道细菌移位对预防SAP继发胰腺坏死感染、改善患者预后具有现实指导意义。材料与方法:（一）检测分析短链脂肪酸在SAP发病过程中含量的变化1、通过GC-MS技术检测SAP患者和健康人群粪便SCFAs含量。2、通过GC-MS技术检测SAP小鼠和正常对照小鼠粪便SCFAs含量。（二）构建SAP动物模型,探讨短链脂肪酸对SAP疾病严重程度的影响。1、构建雨蛙素诱导的SAP小鼠模型,实验分为六个组:control组、cer组、SCFAs＿cer组、乙酸＿cer组、丙酸＿cer组和丁酸＿cer组,比较各组小鼠胰腺损伤程度、胰腺体重比和胰腺病理评分。2、除雨蛙素诱导的SAP模型外,通过构建另外两种SAP动物模型即Bombesin联合雨蛙素模型和M3/ptf1α小鼠SAP模型,验证SCFAs在SAP中的作用,比较各组小鼠胰腺损伤程度。3、分别通过ELISA检测各组小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平,观察雨蛙素诱导的SAP小鼠模型其水平变化及补充SCFAs后的影响。4、通过免疫组化检测各组小鼠胰腺组织MPO（中性粒细胞）和F4/80（巨噬细胞）表达,观察SCFAs对SAP小鼠胰腺组织炎症细胞浸润的影响。5、通过血清多因子ELISA检测各组小鼠血清IL-17A、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和INF-γ的浓度,观察SCFAs对SAP小鼠全身炎症反应的影响。6、为了确定SCFAs在SAP恢复过程中的作用,本研究选择了观察SCFAs对两种SAP小鼠模型（单纯雨蛙素模型和Bombesin联合雨蛙素模型）诱导SAP后第三天的胰腺损伤修复的影响。7、通过HE染色观察SAP小鼠肠道损伤及补充SCFAs后的改变。8、为了观察SCFAs对SAP小鼠肠道炎症反应的影响,本研究通过免疫荧光技术检测了各组小鼠肠道NLRP3的表达,Westren blot检测各组小鼠肠道NLRP3、IL-18、caspase-1 p20和TLR2的表达,PCR检测各组小鼠肠道NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α的相对表达。9、为了观察SCFAs对SAP小鼠肠道屏障功能影响,本研究通过免疫荧光和Westren blot的方法检测各组小鼠肠道occludin和claudin-1的表达和检测血清D-乳酸含量分析SCFAs对小鼠肠道通透性的影响。（三）探讨补充短链脂肪酸引起的肠道菌群变化对SAP严重程度的影响1、为了观察SCFAs对各组小鼠肠道菌群的影响,本研究通过16S r RNA检测了各组小鼠的肠道菌群,分别比较各组小鼠肠道菌群α多样性、β多样性以及差异细菌组成情况。2、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群在SAP中的作用,本研究通过菌群移植的方法给小鼠移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群,观察各组小鼠胰腺损伤情况、胰腺组织炎症细胞浸润、血清淀粉酶脂肪酶和血清炎症因子水平。我们利用了两种小鼠模型验证这一作用:即普通SPF级小鼠和假无菌小鼠模型。3、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群在SAP小鼠肠道损伤中的作用,本研究观察了移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群后对SAP小鼠肠道病理的影响,通过免疫荧光和Westren blot的方法检测了各组小鼠肠道occludin和claudin-1的表达,ELISA方法检测了各组小鼠血清D-乳酸水平,荧光定量PCR的方法检测了各组小鼠肠道炎症因子的相对表达。4、为了进一步研究补充SCFAs对小鼠肠道菌群的影响,具体影响何种细菌从而发挥保护小鼠肠道功能,减轻小鼠SAP。本研究利用组间比较分析的方法比较了正常对照组和SAP造模组小鼠肠道菌群差异。5、为了研究假长双歧杆菌在SAP胰腺损伤和胰腺损伤恢复中的作用,本研究分别观察了补充假长双歧杆菌后,各组小鼠24h和3day时间点小鼠胰腺损伤情况和各组小鼠胰腺组织炎症细胞浸润数量。6、本研究通过检测各组小鼠occludin和claudin-1的表达观察假长双歧杆菌对SAP小鼠肠道屏障损伤的影响。7、本研究通过检测各组小鼠血清炎症因子水平观察假长双歧杆菌对SAP小鼠全身炎症反应的影响。（四）探究短链脂肪酸影响SAP小鼠肠道屏障功能的可能机制1、本研究通过RNA-seq的方法分析SAP小鼠小肠组织基因转录水平的变化,以及SCFAs干预对SAP小鼠小肠组织基因转录水平的影响,筛选出转录组差异基因。2、本研究将正常对照组和SAP组的差异基因集、SAP组和SAP补充SCFAs组的差异基因集分别进行KEGG功能富集分析和通过GSEA分析方法研究相关通路相关基因表达量是否在不同组别具有显著差异。3、为了验证IL-17信号通路在SAP中的作用以及SCFAs对该通路的影响,本研究首先在肠上皮细胞中验证SCFAs对IL-17A激活的影响,其后通过Western blot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。4、为了观察SCFAs处理后小鼠的肠道菌群对IL-17信号通路的作用,本研究通过Western blot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。5、为了观察补充假长双歧杆菌对IL-17信号通路的作用,本研究通过Western blot实验验证各组小鼠小肠组织IL-17A和STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。结果:（一）重症急性胰腺炎疾病状态下粪便短链脂肪酸的含量减少1、收集SAP患者和健康体检人群的粪便,利用GC-MS技术检测两组人群粪便SCFAs含量并进行定量分析。结果发现SAP患者粪便SCFAs与健康人群相比,总酸、乙酸、丙酸和丁酸含量均明显下降。2、构建了小鼠SAP模型,通过GC-MS技术检测两组小鼠粪便SCFAs含量,结果亦发现SAP小鼠粪便SCFAs总酸、乙酸、丙酸和丁酸较正常小鼠明显下降。（二）短链脂肪酸可以减轻小鼠组织急性胰腺炎1、比较control组、cer组、SCFAs＿cer组、Acetate＿cer组、Propionate＿cer组和Butyrate＿cer组六组小鼠胰腺组织病理发现,混合SCFAs处理组小鼠胰腺炎明显减轻,胰腺水肿、炎症细胞浸润和腺泡细胞坏死均明显减少,乙酸、丙酸和丁酸单独处理组小鼠胰腺炎稍有减轻,但效果不如三种混合处理组明显。2、Bombesin联合雨蛙素模型和M3/ptf1α小鼠SAP模型结果也证实SCFAs可以减轻小鼠胰腺组织水肿、炎症细胞浸润以及细胞坏死明显减少。3、ELISA的方法检测了各组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量结果发现单纯SAP造模组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量明显升高,而补充SCFAs组小鼠血清淀粉酶和脂肪酶含量明显降低。4、免疫组化的方法检测了小鼠胰腺MPO（中性粒细胞）和F4/80（巨噬细胞）表达,结果显示,与单纯SAP造模组相比,补充SCFAs组小鼠胰腺组织MPO和F4/80的表达明显减少。5、通过血清多因子检测技术本研究检测了血清IL-17A、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和INF-γ的血清浓度,结果发现补充与单纯SAP造模组相比,补充SCFAs组小鼠血清IL-17A、IL-1β、TNF-α和INF-γ明显降低,IL-6和IL-10与单纯造模组相比无明显差异。6、观察SCFAs对两种SAP模型（单纯雨蛙素模型和Bombesin联合雨蛙素模型）中造模后第三天的胰腺损伤修复的影响,结果发现单纯雨蛙素造模SAP小鼠至第三天时,胰腺组织仍可见大面积胰腺组织损伤,正常腺泡组织比较少,但是,补充SCFAs组SAP小鼠至第三天时可见大片正常的胰腺组织。7、观察不同处理组小鼠的肠道病理发现,单纯雨蛙素造模组小鼠小肠组织较正常对照小鼠比,小肠绒毛变短,部分绒毛顶端缺损,固有层水肿,黏液层变薄,而补充SCFAs后小肠绒毛损伤得到缓解。8、免疫荧光技术检测了各组小鼠肠道NLRP3的表达发现,雨蛙素造模组小鼠肠道组织胞核和胞质均可见明显的NLRP3表达,补充短链脂肪酸后可以减少SAP小鼠肠道NLRP3的表达;Western blot结果发现,与正常对照组小鼠相比,小鼠小肠组织蛋白NLRP3、IL-18、caspase-1 p20和TLR2的表达在单纯雨蛙素造模组明显上调,而补充SCFAs后这些蛋白的表达均明显下降NLRP3、IL-18、caspase-1 p20、TLR2);PCR检测各组小鼠肠道单纯造模组小鼠肠道组织结果发现NLRP3、IL-1β、IL-6、TNF-α较正常对照组明显升高,补充SCFAs组小鼠炎症水平下降,表现为促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显下降,NLRP3炎症小体表达也明显下降,抗炎因子IL-10表达增加。9、免疫荧光和Westren blot的方法检测结果发现单纯SAP造模组小鼠肠道claudin-1和occludin蛋白的表达较正常组明显下调,补充SCFAs后可以增加claudin-1和occludin的蛋白表达;检测单纯SAP造模组和补充SCFAs造模组相比,补充SCFAs组血清D-乳酸含量明显下降。（三）补充短链脂肪酸通过影响小鼠肠道菌群减轻小鼠SAP。1、通过16S r RNA检测了各组小鼠的肠道菌群,结果发现SAP小鼠的Shannon指数和Chao指数较正常对照小鼠低,而SAP小鼠补充SCFAs后肠道菌群的Shannon指数和Chao指数明显增加。继续分析观察各组小鼠肠道菌群的相似性与差异性发现,正常对照组、SAP组和SCFAs＿SAP组三组小鼠肠道菌群有明显的分离趋势,说明三组间存在明显的差异;进一步通过LEf Se分析方法去筛选正常对照组与SAP组的肠道菌群差异细菌以及观察补充短链脂肪酸后SAP小鼠差异细菌的变化发现,SAP小鼠Lachnospiraceae、Bifidobacteriaceae、Streptococcaceae等细菌较正常对照组相对丰度明显降低,而补充SCFAs后可增加SAP小鼠这些细菌的相对丰度。2、移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群亦可以减轻小鼠胰腺炎,小鼠胰腺水肿、炎症浸润及坏死面积明显减少,血清淀粉酶和脂肪酶水平明显下降,胰腺组织MPO和F4/80的表达也明显减少,说明胰腺组织炎症细胞浸润数量明显减少;血清多因子检测结果发现移植经SCFAs处理后小鼠的肠道菌群组小鼠血清炎症因子IL-17A、IL-1β、TNF-α和INF-γ水平明显降低,说明该组小鼠全身炎症反应更轻。3、观察不同处理组小鼠的肠道病理发现移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群SAP组小鼠肠道损伤减轻表现为黏液层更厚,小肠绒毛更长,绒毛顶端缺损减少;且小肠组织occludin和claudin-1的表达更高,血清D-乳酸水平明显下降。荧光定量PCR的结果发现移植SCFAs处理后小鼠的肠道菌群也可以减轻SAP小鼠的肠道炎症,表现为促炎因子IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α表达明显下降,NLRP3炎症小体表达也明显下降。4、本研究利用组间比较分析的方法比较了正常对照组和SAP造模组小鼠肠道菌群差异。结果发现,Lactobacillus＿murinus、Bifidobacterium＿pseudolongum在SAP小鼠丰度明显减少,补充SCFAs后Lactobacillus＿reuteri、Bifidobac-terium＿pseudolongum在补充短链脂肪酸组丰度明显增高,这些细菌与短链脂肪酸的产生密切相关。5、补充Bifidobacterium＿pseudolongum可以明显减轻小鼠胰腺炎,表现为胰腺水肿、炎症和坏死减少,并且在造模第三天时,补充Bifidobacterium＿pseudolongum组小鼠明显恢复,胰腺损伤面积明显减少。6、补充Bifidobacterium＿pseudolongum可以明显减轻SAP小鼠肠道屏障损伤,Western blot结果发现补充Bifidobacterium＿pseudolongum可上调小肠组织occludin和claudin-1的表达。7、补充Bifidobacterium＿pseudolongum可以明显减轻SAP小鼠全身炎症反应。补充假长双歧杆菌可降低SAP小鼠血清促炎因子IL-17A、IL-6和TNF-α水平,增加抑炎因子IL-10水平。（四）短链脂肪酸可能通过调节IL-17信号通路减轻SAP小鼠肠道屏障损伤1、通过RNA-seq的方法分析SAP小鼠小肠组织基因转录水平的变化,以及SCFAs干预对SAP小鼠小肠组织基因转录水平的影响,结果发现:SAP租和对照组之间共有223个差异基因,SAP组小鼠上调的基因有84个,下调的基因有139个（图5.1）。与SAP相比,SAP小鼠补充SCFAs后共有314个基因存在显著差异,其中上调基因69个,下调基因245个。2、KEGG功能富集分析的结果显示:对照组和SAP组的差异基因集显著富集通路主要是“Cholesterol metabolism”,“Fat digestion and absorption”,“IL-17 signaling pathway”,“PPAR signaling pathway”,“AMPK signaling pathway”,“Insulin signaling pathway”等多条KEGG通路。我们继续分析SAP组和SCFAs＿SAP组小鼠小肠组织差异基因集分别进行KEGG功能富集分析,主要富集的通路包括“Fat digestion and absorption”,“IL-17 signaling pathway”,“PPAR signaling pathway”,“Cholesterol metabolism”,“Vitaimin digestion and absorption”,“Estrogen signaling pathway”等KEGG通路。进一步通过GSEA分析的结果显示:SAP发生发展过程中可引起“IL-17 signaling pathway”促炎反应通路的基因上调,而SAP小鼠补充SCFAs后,又可引起“IL-17 signaling pathway”促炎反应通路的基因下调。3、SCFAs抑制肠上皮细胞IL-17A的上调,在SAP动物模型上验证SCFAs在IL-17A信号通路中的作用结果发现,SAP组小鼠IL-17A、STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达较正常组小鼠明显升高,补充SCFAs可以明显降低SAP小鼠肠道组织IL-17A、STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。4、验证移植经SCFAs处理小鼠的肠道菌群对SAP小鼠肠道IL-17信号通路的影响的结果发现,发现移植经SCFAs处理小鼠的肠道菌群组小鼠IL-17A、STAT1、p-STAT1和ROR-γt的蛋白的表达明显下降。5、Western blot检测补充Bifidobacterium＿pseudolongum＿SAP小鼠和SAP小鼠肠道组织蛋白发现,Bifidobacterium＿pseudolongum可以下调IL-17A、STAT1、p-STAT1和ROR-γt的表达。结论:1、重症急性胰腺炎过程中粪便SCFAs含量较正常状态下明显减少。2、补充SCFAs可明显减轻小鼠胰腺病理和SAP相关的肠道炎症和肠黏膜屏障损伤。3、补充SCFAs可影响SAP小鼠肠道菌群,且移植经短链脂肪酸处理后小鼠的肠道菌群和补充Bifidobacterium＿pseudolongum可明显减轻小鼠胰腺炎,因此可推测补充SCFAs可能是通过调节SAP小鼠肠道菌群从而发挥减轻小鼠胰腺炎的作用。4、补充SCFAs和Bifidobacterium＿pseudolongum可以下调SAP小鼠引起的IL-17信号通路的激活,抑制IL-17信号通路可能为重症急性胰腺炎的治疗提供一种新的思路。