水母是一类低等浮游动物,分类学上属腔肠动物门、钵水母纲。水母的分布范围极广,从北纬45。至南纬30。的热带和温带海域均有分布。随着人类对海洋资源开发利用的增加,人类与海洋的接触日益密切,直接导致了人类与水母接触的增多,使得有毒水母蜇伤成为最常见的海洋生物伤,每年全世界都有数以万计的人被水母蜇伤,水母蜇伤后可以产生多种局部或全身症状,严重被蜇伤者可以导致死亡。研究表明水母毒素具有神经、肌肉、呼吸、循环以及肌肤坏死等多种生物活性,其中心血管活性是水母毒素的主要活性之一,心血管毒性被认为是水母蜇伤致死的主要原因。本课题组前期研究发现,我国东南沿海主要致伤水母——发形霞水母(Cyanea capillata)触手提取物(tentacle-only extract, TOE)与刺丝囊毒素(nematocyst venom, NV)心血管蛋白相似,具有相同心血管活性。因此我们采用C. capillata TOE替代NV进行其心血管毒性的研究,以解决样品量不足的难题。在整体动物实验研究中发现,Cyanea capillata TOE具有很强的心血管活性,但TOE所引起的心血管效应主要是全身神经体液调节的结果还是直接作用于心脏或血管所致,仅在整体动物实验的研究层面,难以准确回答,且目前缺少水母毒素对离体心脏和血管的影响及其机理的系统研究。因此,本课题采用Langendorff离体心脏灌注模型和离体主动脉环灌流模型,尽量排除神经体液因素的影响,采用C. capillata TOE作为毒素样品来进行其心血管活性及其作用机理的研究。第一部分：TOE对心脏及其传导系统的影响采用自溶和离心等方法分离、提取C.capillata TOE样品,并用KH液(pH7.35-7.45)透析。麻醉大鼠,开胸取心并悬挂于离体心脏灌流系统,左心室插入球囊以记录左心室压,侧管推注给予不同剂量TOE,观察30min,全程监测HR、LVDP、LVEDP、dp/dt以及CF等指标,连接心电导联记录大鼠离体心脏ECG,分析TOE对大鼠离体心脏心功能以及心脏传导系统的影响。取TOE作用后的大鼠离体心脏,4%甲醛固定,常规病理检查；取TOE作用后的大鼠离体心脏,4%多聚甲醛固定,透射电镜观察TOE对心肌的影响。按上述方法分离、提取C.capillata TOE样品,采用碱变性以及缓冲液更换等方法制备去除溶血活性的TOE(即去溶血组分TOE,也称层TOE)样品,采用KH液(pH 7.35-7.45)透析。麻醉大鼠,开胸取心并悬挂于离体心脏灌流系统,左心室插入球囊以记录左心室压,侧管推注去溶血组分TOE 0.3 mg,观察30 min,全程监测HR、LVDP、LVEDP、dp/dt以及CF等指标,连接心电导联记录大鼠离体心脏ECG。取TOE作用后的SD大鼠离体心脏,4%甲醛固定,常规病理检查,分析TOE与去溶血组分TOE对大鼠离体心脏影响的异同。第二部分：TOE心脏毒性作用机理探讨按上述方法分离、提取C.capillata TOE样品,KH液(pH 7.35-7.45)透析后备用,通过预灌注溶有工具药的KH液或麻醉大鼠颈静脉插管注射工具药等方式进行工具药预处理。SD大鼠左心室插入球囊以记录左心室压,侧管推注给予TOE0.2 mg,监测HR、LVDP、LVEDP、dp/dt以及CF等指标,连接心电导联记录大鼠离体心脏ECG,比较预处理组与TOE 0.2 mg剂量组的心功能指数变化的差异,以初步探究TOE的作用机制。第三部分：TOE对离体主动脉血管环的影响按照上述方法制备C.capillata TOE样品,采用SD大鼠离体主动脉环灌流模型(保留内皮及去除内皮两种实验模型),记录其收缩曲线,研究TOE对血管的影响。第一部分：TOE对心脏及其传导系统的影响给予TOE后,SD大鼠离体心脏HR、LVDP、dp/dt及CF各项心功能指数呈剂量依赖性下降,而LVEDP则呈剂量依赖性上升。病理学检查显示部分心肌纤维变性。透射电镜显示部分心肌纤维断裂、溶解、消失,线粒体发生肿胀,少量线粒体内部脊结构不清晰,遭到破坏。生化分析显示LDH、AST、CK等心肌酶指标显著升高,提示心肌细胞受到破坏。此外,由导出的ECG发现,TOE能够诱发离体心脏的心律失常,并具有剂量依赖性,当TOE 0.5 mg时,可诱发Ⅲ度房室传导阻滞。经过初步分离,成功去除TOE的溶血活性组分,分离后毒素对离体心脏心电图影响不明显,却仍然能够使HR、LVDP、dp/dt及CF各项心功能指数呈剂量依赖性下降,LVEDP呈剂量依赖性上升,但作用均较TOE轻微。病理学检查发现,去溶血组分TOE作用过的离体心脏,可见心肌纤维变性。第二部分：TOE心脏毒性作用机理探讨利用工具药对SD大鼠或离体心脏进行预处理,给予TOE 0.2 mg,心功能变化如下：阿托品：经溶有阿托品的KH液灌注预处理SD大鼠离体心脏,给予TOE后,其心功能指数HR、LVDP、dp/dt及CF呈下降趋势,而LVEDP呈上升趋势。与TOE 0.2 mg剂量组相比,无统计学差异。维拉帕米：经溶有维拉帕米的KH液灌注预处理SD大鼠离体心脏,给予TOE后,其心功能指数HR、LVDP、dp/dt及CF下降,而LVEDP上升。与TOE 0.2 mg剂量组相比,具有统计学差异。地尔硫卓：经溶有地尔硫卓的KH液灌注预处理SD大鼠离体心脏,给予TOE后,其心功能指数HR、LVDP、dp/dt及CF下降,而LVEDP上升。与TOE 0.2 mg剂量组相比,具有统计学差异。肾上腺素：麻醉SD大鼠颈静脉推注肾上腺素进行预处理,开胸取心后用KH液进行平衡灌注,给予TOE,其心功能指数HR、LVDP、dp/dt及CF呈下降趋势,而LVEDP呈上升趋势。与TOE 0.2 mg剂量组相比,无统计学差异。新斯的明：经溶有新斯的明的KH液灌注预处理SD大鼠离体心脏,给予TOE后,其心功能指数HR、LVDP、dp/dt及CF呈下降趋势,而LVEDP呈上升趋势。与TOE 0.2 mg剂量组相比,无统计学差异。第三部分：TOE对离体主动脉血管环的影响参照第一部分,给予保留内皮/去除内皮离体血管环相应剂量TOE,离体主动脉血管环收缩率变化如下：保留内皮组：给予TOE后,离体血管收缩/舒张曲线呈剂量依赖性收缩。去除内皮组：给予TOE后,离体血管收缩/舒张曲线呈剂量依赖性收缩。当TOE剂量达到0.04 g·L-1、0.05 g·L-1时,保留内皮离体血管环的收缩率强于去除内皮离体血管环,具有统计学差异。结论C.capillata TOE具有心脏毒性,可直接作用于心脏的心肌及传导系统,而水母毒素中,溶血活性等其他活性组分在TOE心脏毒性效应的发挥中起重要辅助作用。当TOE剂量为0.1 mg、0.2 mg时,可导致离体心脏心功能下降,但会有一定程度的恢复；然而,当TOE剂量达到0.3 mg及以上时,心功能发生不可恢复的下降。此外,TOE可导致心肌纤维溶解、断裂,线粒体肿胀等病理性变化,相关心肌酶谱分析也显示心肌细胞受到了一定程度的损伤。TOE对心脏的传导系统也具有毒性作用,可诱发不同程度的心律失常,并具有剂量依赖性。当TOE剂量达到0.5 mg时,可诱发Ⅲ度房室传导阻滞。利用工具药探究TOE心脏毒性的作用机理。Ca2+通道阻滞剂维拉帕米、地尔硫卓能够一定程度的拮抗由TOE所引起的心功能下降,证明Ca2+通道是TOE心脏毒性的作用途径之一。然而,胆碱酯酶抑制剂新斯的明,胆碱受体阻断药阿托品,以及α、β肾上腺素受体激动剂肾上腺素则不能拮抗由TOE诱发的心功能下降,从而排除了儿茶酚胺或乙酰胆碱通路在TOE心脏毒性中的作用。0.01 g·L-1-0.05 g·L-1 TOE可诱发动脉血管环的收缩效应,并具有剂量依赖性。然而,TOE所引起的整体致死性心血管效应的主要表现为心血管系统衰竭,血压迅速下降,因此推断TOE诱发的心脏衰竭才是TOE致死的主要原因。此外,较高剂量(0.04 g·L-1、0.05 g·L-1)的TOE引起保留内皮或去除内皮的离体动脉血管环收缩程度不一致,具有统计学差异,说明TOE可诱导血管平滑肌发生收缩反应,且血管内皮在TOE的作用过程中也起着极其重要的作用,具体机制尚不明确,有待进一步深入研究。