成釉细胞瘤(ameloblastomas，ABs)是发生于颌骨的良性的牙源性肿瘤，在中国，其发生约占牙源性肿瘤的36％。肿瘤内主要含成釉器样结构，但无釉质或其他牙体硬组织形成。大多数肿瘤发生于颌骨内，常导致颌骨的膨大和面部变形。ABs虽然为良性肿瘤，与其它良性牙源性肿瘤相比，ABs术后复发几率要较其他良性肿瘤高。WH02005年新分类将ABs分为4种临床病理行为不同的变异型，包括：实性/多囊型、骨外/外周型、促结缔组织增生型和单囊型。这些亚型在患者年龄、部位、影像学表现以及临床预后等方面均存在差异，以往对于其治疗多采用刮除术，由于其复发几率较大，所以目前多以扩大切除术为主，但仍有小部分患者有复发倾向。成釉细胞瘤的局部侵袭性生长是术后容易复发的主要原因，其侵袭机制也是国内外学者研究的重点及热点。近年来，对ABs侵袭性研究主要集中在基因和蛋白两个水平，主要在细胞增殖、凋亡、基质降解以及癌基因，抑癌基因等几个方面。mTOR通路是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号传导通路之一。近来，随着研究的不断深入，人们发现mTOR信号传导通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程，包括对细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管新生以及细胞周期的调控等。该通路在遗传学上的改变和生化条件引起的激活经常发生在恶变早期和肿瘤进展期，同时，该信号通路激活程度也是判断肿瘤患者预后的重要指标。因此抑制该信号通路已成为肿瘤预防和肿瘤靶向治疗的热点。但其在牙源性肿瘤中的表达情况少有报道。我们在前期的工作中发现mTOR上游的调控因子之一 AKT在成釉细胞瘤中存在着强阳性表达，而mTOR极其调控基因在成釉细胞瘤中表达也仅有一位美国学者用免疫组化的方法对32例成釉细胞瘤进行检测，证实其在成釉细胞瘤中存在着阳性表达，TSC1是mTOR通路的重要调控因子，是肿瘤的抑制基因，本研究采用实时荧光定量PCR、Western-blot及免疫组化方法对ABs中mTOR及其调控基因的表达情况进行检测，用PCR直接测序法对TSC1进行突变筛查，从而进一步探讨mTOR极其调控基因在ABs发生、发展及侵袭中的作用。　　 材料与方法：　　 30例ABs样本均来自2007年至2010年在中国医科大学口腔医院颌面外科和病理科，新鲜手术标本-86℃冻存。诊断标准依WHO2005分类标准。以正常黏膜做对照，用Real-time PCR方法，以管家基因β-actin校正，检测ABs中mTOR及4E-BP1，P70S6K，TSC1mRNA表达情况：用Western-blot方法，以β-tublin做内参，检测mTOR及4E-BP1，p70S6K，极其磷酸化的活化形式的蛋白表达；扩大样本至85例用免疫组化SP法观察mTOR，4E-BP1，P70S6K，极其磷酸化的活化形式，TSC1在ABs瘤细胞内表达情况，以了解TSC1，mTOR，4E-BP1，P70S6K在ABs表达情况。进一步通过PCR结合直接测序法筛查TSC1突变情况，深入探讨在ABs中mTOR及其调控基因的表达机制，及其对ABs侵袭性的影响，进而为ABs诊断和治疗提供新的理论依据。　　 实验结果：　　 一、ABs中mTOR，4E-BP1，P70S6KmRNA水平表达结果　　 用Real-time PCR方法，以β-actin做内参，检测了30例ABs中mTOR及其下游因子4E-BP1，P70S6KmRNA表达情况。结果显示ABs中mTOR mRNA表达在ABs中表达相对于黏膜组织中高了1.77倍。4E-BP1其表达水平正常黏膜高2.53倍。P70S6K其表达水平正常黏膜高4.88倍。　　 二、ABs中mTOR，p70S6K及其磷酸化的mTOR，4E-BP1，p70S6K蛋白表达结果　　 用Western-blot方法，以β-tublin做内参，检测了30例ABs中mTOR，4E-BP1，P70S6K及其p-mTOR，p-p70S6K蛋白表达情况。结果显示，mTOR在ABs(1.06±0.53)中的表达显著高于正常黏膜(0.22±0.05)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)，p-mTOR在ABs(1.27±0.57)中的表达显著高于正常黏膜(0.12±0.05)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)，p-4E-BP1在ABs(1.39±0.68)中的表达略高于正常黏膜(1.23±0.25)中的表达，差异不具有统计学意义(P>0.05)，p70S6K在ABs(0.75±0.93)中的表达显著高于正常黏膜(0.41±0.05)中的表达，两者表达也无显著差别(P>0.05)p-p70S6K在ABs(1.37±0.44)中的表达显著高于正常黏膜(0.00)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)。在ABs的原发组和复发组之间，mTOR，p-mTOR无显著差异(P>0.05)，p-4E-BP1，p70S6K，p-p70S6K蛋白表达存在显著差异(P<0.05)。　　 三、ABs中mTOR，4E-BP1，p70S6K，三者磷酸化形式免疫组化结果　　 mTOR在正常口腔黏膜上皮细胞膜为阴性表达，在ABs中胞浆的异位表达，p-mTOR在正常口腔黏膜上皮细胞膜上有完整表达，在ABs中有胞浆及胞核的异位表达，其中胞核阳性为27例(32%)，胞浆阳性为47例(55.3%)。4EBP-1在口腔黏膜胞浆及胞核存在阳性表达，在ABs中4EBP-1为强阳性表达，定位于胞浆与胞核中，p-4EBP-1在ABs中有胞浆及胞核的异位表达，其中胞核阳性为23例(27%)，胞浆阳性为55例(64.7%)。p70S6K在正常口腔黏膜上皮细胞为阴性表达，在ABs中胞浆胞核的异位表达，p-p70S6K在ABs中有胞浆及胞核的异位表达，其中胞核阳性为33例(38.8%)，胞浆阳性为45例(52.9%)，经统计学分析，三者(磷酸化形式)细胞核表达在复发组显著高于原发组，x2分别为43.275，41.150，19.296，P<0.0001，差异具有统计学意义，p-mTOR，p-4E-BP1，p-p70S6K细胞核表达可能与ABs的侵袭行为相关，cox比例风险模型多因素分析结果显示p-mTOR对复发有影响，OR值是6.417，95%CI是1.428-28.824，pmTOR核表达复发危险是浆表达的6.417倍。　　 四、TSC1在ABs中表达及基因突变筛查结果　　 以正常人群做对照，用免疫组化及RT-PCR方法检测TSC1在ABs中的表达，免疫组化结果显示，85例样本中TSC1呈弱阳性表达，较强阳性表达的口腔黏膜染色强度弱，在mRNA水平上TSC1呈下调表达，是正常黏膜的0.66倍，且在突变样本中TSC1表达水平更低，差异有统计学意义(P<0.05)，PCR结合直接测序法检测了TSC1基因全部23个外显子突变情况，结果显示，在20例样品中，有9例样品5个外显子发生了错义突变，分别是TSC1-3、TSC1-5、TSC1-18、TSC1-19、TSC1-22发生了非SNP位点的错义突变，突变率为45%(9/20)。对照组未见有异常。　　 结论：　　 1、ABs中mTOR、4E-BP1、p70S6K基因在mRNA、蛋白质水平在上表达上调，并且mTOR、4E-BP1、p70S6K均有胞浆及核异常表达，提示mTOR、4E-BP1和p70S6K基因在ABs的发生和发展中发挥重要的功能。　　 2、mTOR细胞核表达与ABs侵袭性生物学行为相关，p-mTOR是ABs独立预后因子，p-mTOR的细胞核表达复发的几率是胞浆表达的6.417倍。　　 3、4E-BP1、p70S6K、p-p70S6K细胞核表达与ABs侵袭性生物学行为相关，且复发组蛋白表达水平显著高于原发组蛋白表达，4E-BP1、p70S6K可能与ABs侵袭性生物学行为相关。　　 4、TSC1基因第3、5、18、19、22外显子突变可能是ABs中TSC1基因mRNA表达下调的机制之一。