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目的：原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其恶性程度高，潜伏期长，起病隐匿，进展快，病程短，死亡率高，严重威胁着人们的健康和生命。肝癌的发生是一个复杂而渐进的过程。本研究前期通过在线工具MethHC数据库筛选出启动子甲基化显著差异且与其表达水平呈负相关基因，再结合TCGA数据库的肝癌数据对候选基因进行生物信息学整合分析，并探讨该基因与肝癌预后的关系。本次研究将针对候选基因TBX15在肝癌及相应的癌旁组织和HCC细胞系中进行相关基因表达和功能验证，深入研究该基因启动子甲基化对其mRNA表达的调控和细胞肿瘤行为的影响。 方法：1.生物信息学分析:(1)利用在线工具MethHC数据库筛选肝癌发生发展过程中的启动子甲基化显著差异基因;(2)使用癌症基因组图谱TCGA公共数据库中的HumanMethylation450BeadChip(Illumina)平台下载Level1中的甲基化及mRNA数据和临床数据;(3)使用R软件对原始数据进行整合分析，然后对候选基因TBX15在纳入的肝癌及其癌旁组织样本中进行甲基化和mRNA表达差异分析;(4)Spearman等级相关分析TBX15基因启动子甲基化对其mRNA表达的影响;(5)Log-rank test与COX比例风险回归模型分析TBX15基因在肝细胞癌中启动子甲基化与患者预后的关系。 2.基因表达分析:应用实时荧光定量分析方法，在30对肝细胞癌与其对应的癌旁组织样本中检测启动子发生异常甲基化的TBX15基因mRNA表达情况。 3.细胞甲基化验证及功能实验:(1)利用生物信息学查找TBX15基因的5上游序列，预测启动子区域和CPG岛位置，并用相关软件设计引物;(2)应用亚硫酸氢盐测序法BSP、实时荧光定量PCR以及Western blot检测3株肝癌细胞系（HepG2、MHCC97H、SNU-449）中TBX15基因启动子的甲基化状态以及mRNA和蛋白表达水平，并比较筛选出甲基化程度最高和表达最低的细胞系;(3)构建TBX15过表达载体转染至SNU-449细胞中，再用RT-PCR、WB测定TBX15基因mRNA和蛋白表达水平变化;(4)以转染空白质粒和空载质粒pc3.1的SNU-449细胞为对照，通过CCK-8实验、Transwell迁移和侵袭实验、流式细胞术实验检测空白组、空载组、过表达组肝癌细胞系的增殖、迁移和侵袭、凋亡能力。 结果：1.生物信息学数据分析显示:(1)MethHC数据库筛选出在肝癌中启动子甲基化显著差异且与其表达水平呈负相关基因TBX15;(2)TCGA数据库显示:肝细胞癌组织中，TBX15基因启动子甲基化升高同时表达降低;(3)Spearman等级相关分析验证:TBX15基因启动子甲基化水平与其mRNA表达水平呈负相关关系;(4)Log-rank test显示:TBX15启动子甲基化水平低的肝细胞癌患者较甲基化水平高的生存率高;(5)COX比例风险回归分析显示:TBX15启动子甲基化进行该疾病的独立预后检验差异有统计学意义(P=0.045)。 2.基因表达分析结果显示:采用实时荧光定量实验对TBX15基因mRNA表达水平进行验证，结果显示TBX15基因呈低表达水平。 3.细胞甲基化检测:根据BSP结果计算启动子甲基化率，3株肝癌细胞系的甲基化率分别为57.4％(HepG2)、78.9％(MHCC-97H)、89.5％(SNU-449)。由此可看出，TBX15在SNU-449细胞中甲基化程度最高。 4.实时荧光定量PCR:在3株肝癌细胞系中，TBX15在MHCC-97H和SNU-449细胞中几乎不表达，在HepG2细胞中较高表达;构建TBX15过表达载体转染至SNU-449细胞后，以空白质粒组的2-△△Ct值为1，分析结果显示，过表达组中TBX15mRNA的水平明显高于空载质粒组和空白质粒组。 5.Western Blot实验:以GADPH为内参，检测3株肝癌细胞系中TBX15蛋白的表达情况，结果显示，TBX15在3株肝癌细胞系中表达均下调;构建TBX15过表达载体转染至SNU-449细胞后，与空白质粒组和空载质粒组相比，过表达质粒组细胞的蛋白表达上调。 6.CCK-8实验:检测空白质粒组、空载质粒组和过表达质粒组细胞在OD450nm处的OD值，结果显示，分别培养24h和72h后，三组对肝癌细胞增殖能力的影响不存在差别，而在培养48h后，过表达质粒组对肝癌细胞的增殖能力高于空载质粒组（P=0.015）。 7.Transwell细胞迁移和侵袭实验:通过染色光镜图、视野细胞计数以及OD590nm处的OD值结果分析发现，空白质粒组、空载质粒组和过表达质粒组对肝癌细胞的迁移和侵袭能力影响无差别。 8.流式细胞凋亡实验:通过早期和晚期凋亡计数结果分析发现，过表达质粒组对肝癌细胞的凋亡能力的影响高于空白质粒组和空载质粒组(P=0.036)。 结论：1.肝细胞癌中，TBX15启动子高甲基化抑制其mRNA的表达水平;2.TBX15启动子甲基化可能与肝细胞癌的预后有关;3.成功构建了过表达TBX15基因的肝癌细胞系SNU-449，TBX15基因过表达可能增强肝癌细胞的凋亡能力;4.TBX15基因甲基化与肝细胞癌恶性生物学行为相关，是肝细胞癌发生进展和不良预后的一个可供参考的预测指标。