肉鸡坏死性肠炎(Necrotic Enteritis,NE)是主要由A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)引起的一类成因复杂的肠道疾病。由于抗生素作为促生长剂的禁用,NE已成为威胁养鸡行业的重要疾病之一。其中亚临床型坏死性肠炎(Subclinical NE,SNE)由于没有明显眼观症状,很难及时发现,因而易造成更大的经济损失和食品安全问题。益生菌被视为“后抗生素时代”防控SNE最重要的手段之一,值得进行深入研究和开发。约氏乳杆菌BS15(Lactobacillus johnsonii BS15)由本课题组分离得到,已被证明对包括肉鸡在内的多种动物具有益生效果。本文对应用BS15防控肉鸡SNE的作用效果及机理进行了研究。第一部分:BS15对肉鸡的促生长作用及机理研究本研究首先检测了BS15作为益生菌对肉鸡生长性能的提升作用,并分析了机理。试验选用1日龄肉鸡健雏180只,随机分为3组,一组饲喂普通日粮,另外两组饲喂BS15日粮(其中一组菌液在饲喂前经超声波破碎),并于试验21天和42天进行采样检测。结果发现BS15可通过对肠道微生态的调节来提升小肠发育水平和消化能力,并显著改善机体脂质代谢水平,包括肝脏和腹脂中脂质代谢相关基因的表达量以及相关的血清生化指标,显著提升了肉鸡的生长性能并降低了腹脂率;与此同时,本研究发现BS15活菌是发挥益生作用的必要条件。第二部分:BS15对SNE肉鸡生长性能和肉质下降的预防效果研究我们随后将益生效果已被验证的BS15应用于对SNE肉鸡长势和肉质下降的预防效果研究。试验选用1日龄肉鸡健雏480只,随机分为4组,包括空白对照组、造模组以及两个不同浓度的BS15预防组,并于试验42天进行采样检测。结果发现BS15显示出对SNE导致的肉鸡生长性能迟缓、肠道通透性增加、以及鸡肉适口性和营养成分的降低具有良好的预防作用,其中变化较为明显的为鸡肉酸度、保水力、嫩度以及氧化损伤相关指标,同时BS15显著改变了包括EPA和DHA等重要营养物质在内的肌肉脂肪酸组成。以上两部分研究结果表明BS15作为饲料添加剂对肉鸡具有促生长作用,并可以有效预防SNE所造成的长势及鸡肉品质下降。该结论为深入揭示BS15预防SNE的作用机制提供了理论基础。第三部分:BS15预防肉鸡SNE的作用机理研究试验选用1日龄肉鸡健雏300只,随机分为5组,包括空白对照组、造模组、BS15组、预防组(造模前饲喂BS15)和治疗组(造模后饲喂BS15),试验进行42天,从生长性能结果统计中,我们发现BS15可以有效预防SNE对增重和饲料转化率的影响。同时,我们针对肠道黏膜免疫和血液中免疫相关指标,在28天对前三组进行了采样检测,旨在揭示预防过程中对局部和全身免疫能力的作用机制。结果如下:1.对肠道组织学结构的影响对回肠和盲肠扁桃体进行了组织学观察,发现造模组回肠绒毛结构出现了损伤,主要呈现为上皮细胞脱落、淋巴细胞数量增加以及固有层增厚,BS15组回肠除固有层增厚以外没有明显损伤;盲肠扁桃体几乎没有变化。2.对IgA+B淋巴细胞和免疫球蛋白水平的影响免疫组织化学法和ELISA技术分别用于测定IgA+B淋巴细胞数量和免疫球蛋白含量。结果发现BS15可以预防由SNE引起的回肠IgA+B细胞数量减少现象;回肠中免疫球蛋白水平IgA、sIgA和IgG水平以及血清中IgA和IgG水平会因SNE的发生而下降,而在BS15的作用下有明显的提升作用。3.对T淋巴细胞亚群的影响通过流式细胞术检测了外周血、回肠和盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群变化。在回肠上皮层与盲肠扁桃体上并没有十分显著的影响,固有层变化显著,与SNE的发生和BS15的预防作用联系紧密,且回肠固有层结果与外周血变化规律一致。4.对细胞凋亡的影响在对血清及肠道氧化应激检测中发现,血清和回肠的抗氧化能力在SNE组有损伤,包括MDA水平和SOD活性等指标发生显著变化,同时在BS15组有显著缓解。在回肠中,caspase-3、Bax等凋亡蛋白水平及mRNA表达量均由于BS15的添加而降低了SNE的影响。血液与肠道作用规律一致,且蛋白水平变化与基因变化规律一致。5.对细胞因子含量及基因表达水平的影响通过ELISA技术和RT-qPCR检测结果表明,回肠IL-2、IL-8、IL-10和IFN-γ以及血清中IL-2、IL-4和IFN-γ受到SNE的影响较大,而该影响在BS15先期加入的情况下得到了改善。综合以上结果,本研究可以得出如下结论:肉鸡SNE的发生将引发肠道黏膜免疫水平降低,并致使血液免疫受到同样的影响。约氏乳杆菌BS15的添加可以防控SNE造成的表型变化和免疫功能损伤。利用肉鸡肠道在前期发育不完全,对氧化损伤和损伤所引发的细胞凋亡现象的抑制可能是保护肉鸡免疫功能的分子基础。此外,BS15的添加显著缓解外周血和回肠固有层T淋巴细胞亚群的损伤和回肠IgA+B细胞数量降低、以及肠道与血清免疫球蛋白和细胞因子分泌减少,以上现象可能是BS15预防SNE所致免疫功能受损的直接原因和途径。