雌激素是由卵巢等组织分泌的类固醇激素,它通过与机体多种靶组织细胞中的受体结合,对生殖系统、乳腺、骨骼、神经及心血管系统的发育和功能发挥调节作用。雌激素在临床上被用于预防和治疗更年期综合症、骨质疏松、心血管疾病等,但体内长期高水平雌激素的刺激可导致许多组织的癌变。研究表明,雌二醇(estradiol,E2)及其部分代谢产物是诱发乳腺癌、子宫内膜癌的重要因素。而雌激素的作用与其受体密不可分。雌激素受体(ER)是甾醇类激素受体的一种,属于核受体超家族成员,定位于细胞核和细胞质中。ER与其配体结合成为具有活性的转录因子,启动多种基因的转录,促进细胞增殖并抑制细胞凋亡信号通路。ER的过表达与乳腺癌和一些妇科肿瘤的发生密切相关。成熟的ERα分子从氨基端到羧基端,由A—F六个结构域组成。N端的A/B区为AF1(activation function)功能区,是高度可变区,参与受体对靶基因的反式转录激活;C区即高度保守的含有两个锌指结构的DNA结合结构域(DNA-binding domain,DBD),是受体与DNA特异性结合及二聚化功能区;D区可与热休克蛋白(HSP)结合,并具有核定位信号。C端的E/F区包含配体结合结构域(ligand-binding domain,LBD),具有与特异配体结合的特性及反式激活结构域AF2(activation function-2)。AF1具有配体(雌激素)不依赖的转录激活功能,而AF2则具有配体依赖的转录激活功能。AF1和AF2的有效转录激活依赖于ER与其他蛋白质的相互作用。这些与ER结合的蛋白质被称为ER共调节因子(coregulators),分为共激活因子(coactivators)和共抑制因子(corepressors)。当ER与激素等配体结合后,构象发生变化,形成稳定的二聚体,并与DNA中具有回文结构的特定元件(ERE)结合,随后ER可以通过不同的辅激活因子与靶基因的转录元件相互作用,启动基因转录。由于雌激素与雌激素受体在妇科肿瘤的发生发展中所起到的重要作用,因此对于这类肿瘤的机制与治疗的研究也大多集中在如何逆转雌激素的作用和/或通过雌激素受体诱导肿瘤细胞发生凋亡,这也是本研究的目的与意义所在。一、miR-106b-93-25簇在子宫内膜癌恶性表型中作用机制的研究以TAM(Tamoxifen)为代表的选择性雌激素受体调节剂(SERMs)在乳腺癌等肿瘤的治疗中已被广泛应用,然而它们在不同组织中诱发的细胞内信号、基因表达变化以及最终的生物学效应显著不同。TAM在有效抑制乳腺癌细胞增殖的同时,却增加了子宫内膜癌发生的危险,其分子机制尚有待阐明。ER与其配体结合后,可以募集多种共激活因子/共抑制因子形成复合体来共同调控基因的表达。这些复合体中的一些分子具有组蛋白乙酰基转移酶HAT(histone acetyltransferase)活性,可以乙酰化组蛋白。很多可逆的或不可逆HDAC抑制剂,如TSA(trichostatin A),能够阻断这一过程,进而调控基因的表达。一些研究已经证实,在乳腺癌,TAM与ER结合后能与包含组蛋白去乙酰化酶活性的共抑制复合体相互作用,从而导致染色质凝聚和基因沉默。MicroRNA(miRNA)是由约22个核苷酸组成的非编码的小分子RNAs。它们能够在转录后水平,通过与靶基因mRNA的互补结合负调控靶基因的表达。研究发现,miRNA的异常表达与多种癌症相关,因此miRNA在肿瘤发生发展过程中可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。实验证实,TSA作用于子宫内膜癌细胞ECC-1和HEC-1A后,细胞增殖能力明显减弱;流式细胞术检测发现,TSA作用后的细胞与对照相比发生显著的G1期阻滞,细胞凋亡也明显增加。进而,对TAM单独或联合应用TSA刺激的ECC-1细胞系进行了microRNA芯片分析。分析结果显示,TAM和TSA联合应用组与对照组相比microRNA106b-25-93簇的表达明显下调,而TAM单独应用组与对照组相比该miRNA簇无明显变化。进一步的实验显示TSA能够下调miR-106b-25-93簇及其宿主基因MCM7的表达。因此推测TSA对miR-106b-25-93簇的表达具有间接调控作用。将人工合成的miR-106b、miR-93和miR-25及其抑制剂miR-106b Inhibitor、miR-93 Inhibitor和miR-25 Inhibitor分别转染人子宫内膜癌细胞ECC-1,发现转染miR-106b Inhibitor的细胞与对照组相比,发生了明显的G1期阻滞,在转染miR-93 Inhibitor的细胞也出现了相似的结果,而转染了miR-25 Inhibitor的细胞与对照组比较凋亡率增加。该结果说明miR-106b-25-93簇在子宫内膜癌细胞中具有抑制凋亡和促进细胞增殖的作用。实验中,我们构建了细胞周期激酶抑制蛋白p21和促凋亡蛋白Bim的3’UTR双荧光素酶报告系统,通过与miRNA分子的共同转染,证实p21和Bim分别是miR-106b和miR-25调控的靶基因。TSA刺激子宫内膜癌细胞引起miR-106b-25-93簇表达下调,因而解除了后者对p21和Bim表达的抑制,最终导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。Western blot检测证实,TSA能够通过对miRNA簇的调节上调靶基因p21和Bim的表达。通过生物信息学软件预测,该miRNA簇的启动子区存在c-Myc的结合位点,我们的实验也证实了c-Myc的这一调控作用。而TSA对于c-Myc蛋白的下调作用也由Western blot得到证实。综上所述,我们通过体外实验及临床标本的检测证实,子宫内膜癌细胞中存在一个调控通路:c-Myc能够促进miR-106b-93-25簇及其宿主基因MCM7的表达,而miR-106b-93-25簇通过抑制p21与Bim促进子宫内膜癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。TSA可以下调c-Myc的表达,从而间接实现了对miR-106b-25-93簇及其宿主基因MCM7的调控,引起细胞周期阻滞与细胞凋亡。该调控通路的发现,为子宫内膜癌的治疗提供了新的方向和理论依据。二、雌激素诱导ER与Caspase-8融合基因修饰乳腺癌细胞凋亡的分子机制研究细胞凋亡作为一种自发的程序化的死亡过程,在多细胞生物的组织分化、器官发育、机体稳态的维持中有着重要意义,并参与多种疾病的病理过程。半胱天冬酶(caspase)是不同凋亡途径中共同的末端蛋白酶,caspase在细胞中以酶原形式存在,包含1个N端原结构域(prodomain)、大亚基和小亚基。在上游凋亡信号作用下,caspases发生同源聚集发生交互切割而活化,游离的大、小亚基结合成活性caspase分子,广泛作用于细胞结构和功能蛋白,诱发细胞凋亡。细胞发生凋亡时,caspase可以通过多种信号途径被激活。近年来的研究表明,在上游信号的诱导下,起始caspase分子相互接近,并形成同源二聚体是caspase活化的关键步骤。ER在细胞中通常与热休克蛋白HSP90结合而不具有转录激活活性,当与激素等配体结合后,构象发生变化,与HSP90解离,形成稳定的二聚体,并与DNA中具有回文结构的特定元件(ERE)结合,随后ER可以通过不同的辅激活因子与靶基因的转录元件相互作用,启动基因转录。综上所述,将以caspase为主导的细胞凋亡的分子机制导入肿瘤细胞,并以一种可被小分子诱导的方式启动该机制,可以选择性地杀伤肿瘤细胞。基于此设想,我们构建了caspase8和ERα融合蛋白的真核表达载体,将其分别转染并表达于ER阳性和阴性乳腺癌细胞,并筛选单克隆,建立转染细胞系。通过RT-PCR与Western blot证实了融合蛋白基因在转录水平和翻译水平的表达。为了验证雌激素可以诱导融合蛋白发生二聚化,我们又构建了带有FLAG和His标签的融合蛋白真核表达载体。间接免疫荧光实验证实了当有雌激素存在时,两种标签的融合蛋白在细胞内发生共定位。而免疫共沉淀实验和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳则直接验证了雌激素诱导下的融合蛋白分子发生二聚化,形成二聚体。稳定转染了融合蛋白真核表达载体的ER阳性和ER阴性乳腺癌细胞,在雌激素诱导下均发生了细胞增殖减缓和细胞凋亡增加。在裸鼠的融合蛋白表达肿瘤模型,雌激素同样表现出了诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用,肿瘤体积变小,肿瘤生长减慢。切除的肿瘤组织制作石蜡切片,进行组织化学染色和TUNEL检测,发现融合蛋白表达的肿瘤细胞在雌激素作用下发生了细胞凋亡。因此,我们的研究建立了一种新的caspase8诱导活化的细胞模型,并有助于逆转雌激素促进细胞增殖的效应,使之转而成为细胞凋亡的促进剂,从而为特定类型肿瘤(如雌激素依赖的肿瘤)的治疗提供一种新思路。