研究背景卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、易转移、预后差等特点[1]。由于早期缺乏特异性的诊断手段，超过70%的卵巢癌患者就诊时已有盆腔转移或淋巴转移，被确诊为中晚期[2]。而对于中晚期及肿瘤细胞减灭术后的卵巢癌患者，化疗是主要的治疗手段之一。尽管以铂类为基础的联合化疗取得了一定的进展，但其5年生存率仍未见明显提高。顺铂是被广泛应用的一线化疗药物[3]，在多种实体肿瘤中均具有明显的抗肿瘤活性。然而随着耐药现象的出现，其疗效不尽如人意。因此，寻找卵巢癌顺铂耐药的分子靶点或有效的逆转剂已经成为当今卵巢癌治疗中亟待解决的关键问题。S100A4（S100calcium-binding protein A4）是钙结合蛋白S100家族成员之一[4]。S100蛋白作为一种钙传感器蛋白，通过Ca2+信号转导途径在细胞周期调控、细胞增殖分化、细胞黏附运动、酶的激活及细胞凋亡中发挥着重要作用[5]。许多研究证实，S100A4在肾癌、结肠癌、胃癌、胆管癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，与肿瘤的发生发展、侵袭转移及化疗敏感性密切相关，并可作为判断肿瘤复发及患者预后的有效指标之一[6-10]。那么S100A4在卵巢癌治疗具有什么作用？其与顺铂耐药性之间又具有什么关系呢？这些问题都需要进一步研究。本研究拟以卵巢癌细胞为研究对象，采用Western blot、实时荧光定量PCR、免疫细胞化学法检测卵巢癌细胞中S100A4的表达，并分析其与顺铂耐药之间的关系；其次以卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780和耐药细胞株CP70为研究对象，观察S100A4重组质粒及siRNA沉默S100A4基因对细胞顺铂敏感性的影响。本研究为S100A4参与卵巢癌顺铂耐药的形成提供有力的实验依据，并为进一步探讨其在卵巢癌顺铂耐药中的作用机制奠定基础。目的1.观察S100A4在卵巢癌细胞中的表达；2.观察S100A4的表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的相关性；3.观察S100A4重组质粒及S100A4siRNA对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响，为进一步分析S100A4成为逆转卵巢癌顺铂耐药的分子靶点提供依据。方法及内容1.以卵巢癌细胞株SKOV3，顺铂敏感细胞株A2780、耐药细胞株CP70，高转移细胞株HO-8910PM、低转移细胞株HO-8910为研究对象，应用实时荧光定量PCR、Western Blot观察S100A4在卵巢癌细胞中的表达。2.以顺铂敏感细胞株A2780和耐药株CP70为研究对象，采用免疫细胞化学法观察S100A4在细胞中的表达及亚细胞定位；应用MTT法检测细胞对顺铂的敏感性差异；实时荧光定量PCR、Western Blot观察顺铂处理CP70后S100A4的表达变化，分析S100A4的表达与卵巢癌细胞顺铂耐药的相关性。3.以顺铂敏感细胞株A2780为研究对象，应用重组DNA技术构建重组质粒S100A4-pEGFP-N1，应用实时荧光定量PCR、Western Blot观察转染后S100A4的表达，MTT法观察卵巢癌细胞顺铂敏感性的变化。4.以顺铂耐药细胞株CP70为研究对象，应用siRNA技术沉默S100A4基因，实时荧光定量PCR、Western Blot观察转染后S100A4的表达，MTT法观察S100A4siRNA对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响。结果1.在5种卵巢癌细胞株中，S100A4在顺铂耐药细胞株CP70中的表达最高，而在敏感株A2780中表达最低；2. S100A4在A2780及CP70中均为胞浆表达。顺铂对A2780和CP70的IC50值分别为17.09μM和62.10μM。顺铂处理CP70细胞后，S100A4的mRNA及蛋白表达具有剂量及时间依赖性。3. S100A4-pEGFP-N1重组质粒转染A2780细胞后，顺铂对细胞的IC50值较空白对照组的19.06μM上升至转染组的51.09μM，对顺铂耐受性提高了2.69倍。4. S100A4siRNA转染CP70细胞后，S100A4mRNA及蛋白的表达下调，顺铂对CP70细胞的IC50值较空白对照组的64.38μM下降至转染组的38.12μM，对顺铂敏感性提高了1.69倍。结论1. S100A4在卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780中呈低表达，而在耐药细胞株CP70中呈高表达，高表达S100A4的CP70细胞对顺铂的敏感性显著降低，同时顺铂可诱导CP70中S100A4表达的上调，且其在细胞质中发挥耐药作用，提示S100A4的高表达与卵巢癌顺铂耐药密切相关；2. S100A4-pEGFP-N1重组质粒上调S100A4的表达，能够提高卵巢癌A2780细胞对顺铂的耐受性。相反，S100A4siRNA特异性沉默S100A4的表达，能够提高卵巢癌CP70细胞对顺铂的敏感性。这提示，S100A4在卵巢癌细胞顺铂耐药中发挥重要作用。