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目的:建立人神经胶质瘤阿霉素耐药细胞株SHG44/ADM,并初步探讨其发生多药耐药的可能机制。方法:1、应用阿霉素浓度递增和间歇诱导法建立SHG44/ADM耐药株。2、采用CCK-8法检测不同抗肿瘤药物对人神经胶质瘤细胞增殖的影响,计算半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI),观察冻存、撤药对耐药稳定性的影响。3、比较耐药株与亲本细胞株细胞形态、细胞贴壁率、生长曲线、群体倍增时间的差异。4、双层软琼脂实验测SHG44/WT和SHG44/ADM克隆形成率。5、流式细胞仪检测SHG44/WT和SHG44/ADM细胞周期。6、RT-PCR检测MDR-1、MRP1和LRP的mRMA表达量,免疫印迹法检测MDR-1、MRP1、LRP、COX-2和PKC的蛋白表达量。7、罗丹明实验测SHG44/WT和SHG44/ADM对药物的摄入、排出能力。8、流式细胞仪和荧光显微镜检测SHG44/WT和SHG44/ADM细胞的凋亡率。结果:1、SHG44/ADM对阿霉素的耐药指数为10.7,冻存对耐药无明显影响,而撤药可降低耐药性,而且SHG44/ADM对多种抗肿瘤药物均产生不同程度的耐药性。2、SHG44/ADM相对于SHG44/WT细胞形态无明显差异,但生长曲线缓慢,细胞群体倍增时间延长(32.22±0.52h vs 26.67±0.49 h)。3、SHG44/WT亲本细胞和SHG44/ADM耐药细胞克隆形成率分别为:20%,52%,耐药细胞的克隆形成率显著增加。4、相对于亲本SHG44/WT细胞(G1期为31.40±5.7,S期为19.60±3.5,G2/M期为39.3±4.9),SHG44/ADM耐药细胞(G1期为45.47±6.8,S期为35.73±5.3,G2/M期7.8±2.6)的G1,S期所占比例增加,G2期所占比例减少。5、RT-PCR检测SHG44/ADM耐药细胞株MDR-1的mRMA表达量明显增强,而MRP1、LRP无明显变化。6、免疫印迹发现SHG44/ADM耐药细胞株MDR1表达明显增强,而MRP1和LRP表达无明显变化,COX-2和PKC 的蛋白表达量增强。7、SHG44/ADM对罗丹明摄入减少,排出增多。8、荧光显微镜分析表明ADM对耐药细胞SHG44/ADM的凋亡率明显减少,加入MDR1抑制剂干预后可明显增加ADM对SHG44/ADM细胞的凋亡率。结论:1、成功建立人神经胶质瘤阿霉素耐药细胞株SHG44/ADM。2、SHG44/ADM耐药机制可能与MDR1的表达增加,抗癌药物摄入减少,外排增多,减少药物对肿瘤细胞的凋亡作用相关。3、阿霉素耐药细胞株SHG44/ADM的COX-2和PKC 的蛋白表达量增强。目的:探讨PKC 、COX-2在人神经胶质瘤细胞多药耐药中的作用,分析PKC 、COX-2、MDR1三者之间的关系,揭示人神经胶质瘤细胞发生多药耐药的机制。方法:1、采用CCK-8法检测阿霉素对不同处理方式人神经胶质瘤细胞的增殖作用影响,计算半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI)。2、台盼蓝拒染试验分析存活细胞和死亡细胞的数目。3、免疫印迹法检测MDR-1、COX-2和PKC 的蛋白表达量4、激酶分析PKC的活性。5、酶联免疫分析PGE2的生成量。6、荧光分光光度计检测细胞内阿霉素的浓度。7、流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1、与SHG44/WT细胞相比,SHG44/ADM细胞对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率增高(P<0.05) ,PKC 蛋白表达和PKC活性增加,COX-2蛋白表达和PGE2生成量也增加,MDR1蛋白表达增加,细胞内阿霉素浓度降低,10 g/ml阿霉素处理细胞后凋亡率减少。用10 M浓度的PKC抑制剂Staurosporine干预SHG44/ADM后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率降低(P<0.05) ,PKC 蛋白表达增加但PKC活性明显降低,COX-2蛋白表达和PGE2生成量减少,细胞内阿霉素浓度增高,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率增加(均相对于SHG44/ADM细胞)。用25 M浓度的COX-2特异性抑制剂NS398处理SHG44/ADM细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率降低(P<0.05) ,PKC 蛋白表达和PKC活性无明显变化,COX-2蛋白表达增加但PGE2生成量明显减少,细胞内阿霉素浓度增高,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率增加(均相对于SHG44/ADM细胞)。2、与SHG44/WT细胞相比,100ng/mlPMA处理的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率增高(P<0.05) ,PKC 蛋白表达和PKC活性增加,COX-2蛋白表达和PGE2生成量也增加,细胞内阿霉素浓度降低,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率减少。用10 M浓度的PKC抑制剂Staurosporine干预100ng/mlPMA处理的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率降低(P<0.05) ,PKC 蛋白表达增加但PKC活性明显降低(P<0.01),COX-2蛋白表达和PGE2生成量减少,细胞内阿霉素浓度增高,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率增加(均相对于100ng/mlPMA处理的SHG44/WT细胞)。用25 M浓度的COX-2特异性抑制剂NS398处理100ng/mlPMA处理的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率降低(P<0.05) ,PKC 蛋白表达和PKC活性无明显变化,COX-2蛋白表达增加但PGE2生成量明显减少,细胞内阿霉素浓度增高,10 g /ml阿霉素处理细胞后其凋亡率增加(均相对于100ng/mlPMA处理的SHG44/WT细胞)。3、与SHG44/WT细胞相比,转染10 g/mlpCMV-COX2质粒的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率明显增高(P<0.01),PKC 蛋白表达和PKC活性无明显变化,COX-2蛋白表达和PGE2生成量显著增加(P<0.01),细胞内阿霉素浓度明显降低,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率明显减少。用10 M浓度的PKC抑制剂Staurosporine干预转染10 g/mlpCMV-COX2质粒的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率无明显变化,PKC 蛋白表达增加但PKC活性降低,COX-2蛋白表达和PGE2生成量无变化,细胞内阿霉素浓度无明显变化,10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率无明显变化(均相对于转染10 g/mlpCMV-COX2质粒的SHG44/WT细胞)。用25 M浓度的COX-2特异性抑制剂NS398处理转染10 g/mlpCMV -COX2质粒的SHG44/WT细胞后其对阿霉素的半数抑制率、耐药指数和细胞存活率降低(P<0.01) ,PKC 蛋白表达和PKC活性无明显变化,COX-2蛋白表达增加但PGE2生成量明显减少,细胞内阿霉素浓度增高, 10 g/ml阿霉素处理细胞后其凋亡率明显增加(均相对于转染10 g/ml pCMV-COX2质粒的SHG44/WT细胞)。结论:1、PKC 蛋白表达和PKC激活介导MDR1的表达,促进阿霉素的外排,减少肿瘤细胞的凋亡。2、COX-2蛋白表达和PGE2生成介导MDR1的表达,促进阿霉素的外排,减少肿瘤细胞的凋亡。3、PKC 通过激活COX-2/PGE2系统介导MDR1的表达,促进阿霉素的外排,减少肿瘤细胞的凋亡,产生多药耐药。