背景：人诱导性多能干细胞（hiPSCs）具有体外三胚层分化潜能，这一特性使其近年在再生医学研究领域应用广泛。将hiPSCs在体外分化为神经前体细胞(NPCs)，进而分化为神经元或特定种类神经元，能克服在体神经干细胞获取困难及胚胎干细胞来源神经前体细胞的伦理争议等问题，为神经系统退行性疾病终末期病人的细胞治疗提供种子。帕金森病(PD)是神经系统最为常见的退行性疾病之一。其主要病理改变为中脑黑质致密部多巴胺能神经元（DANs）选择性丢失导致DA递质合成功能减退。目前其治疗手段多为药物治疗，方式单一，长期疗效效果不佳。将hiPSCs诱导分化为DANs是PD病人细胞治疗的前提保证。但到目前为止hiPSCs分化为DANs的效率不高，分化机制尚不明确，有待进一步研究。　　第一部分 hiPSCs向神经前体细胞及神经元的诱导分化及细胞间microRNAs的差异表达研究　　目的:建立hiPSCs向NPCs诱导及向神经元（neurons Ns）分化的培养体系；寻找hiPSCs、hiPSCs来源NPCs及hiPSCs来源Ns中microRNAs的差异表达。方法：采用单层贴壁培养法，借助N2/B27神经干细胞诱导培养基及GDNF/BDNF神经元分化培养基，将hiPSCs向NPCs及Ns进行诱导分化。Trizol法提取不同阶段细胞的RNA，通过高通量测序手段分析三个不同阶段细胞miRNAs的表达差异；并对差异表达明显的miRNAs进行生物学信息研究。　　结果：Nestin标记流氏分析结果显示，通过单层贴壁诱导培养法能将超过60%的hiPSCs诱导为Nestin阳性的NPCs。通过该方式诱导得到的NPCs能进一步分化为TUJ1及MAP2阳性的Ns。高通量测序结果显示在三个不同阶段的细胞中存在多条miRNAs的差异表达。其中miR-135a-5p在hiPSCs来源的NPCs分化为Ns后表达明显上调，RT-qPCR验证了这一结果（p＜0.01）。生物信息学分析发现miR-135a-5p的多个靶基因定位于经典WNT信号通路上包括GSK3B，其表达的变化与经典WNT信号通路的活性密切相。　　结论：通过单层贴壁诱导法能将超过60%的hiPSCs诱导为NPCs，得到的NPCs可分化为神经元。在hiPSCs、hiPSCs来源NPCs及hiPSCs来源的Ns中存在着miRNAs的差异表达，提示可通过调节相关miRNAs的表达来调节hiPSCs向神经类细胞诱导分化，实现hiPSCs向神经类细胞的高效诱导。　　第二部分 调节经典Wnt信号通路实现hiPSCs源性FP-NPCs向DAPCs的高效诱导　　目的：建立hiPSCs向底板类神经前体细胞（floor plateneural precursor cellsFP-NPCs）诱导的培养体系；通过调节经典Wnt信号通路活性，实现FP-NPCs向多巴胺能神经前体细胞（DAPCs）的高比例转化，进而实现DANs的高效分化。　　方法：采用改良的底板细胞诱导法将hiPSCs向FP-NPCs进行诱导,常规检测底板细胞标志物(FOXA2,SHH,NETRIN-1)的mRNA及蛋白表达。在诱导的第7天向培养基中添加合适浓度的GSK3B抑制剂Chir99021或β-catenin siRNA，上调或下调经典Wnt信号通路活性实现dFP-NPCs向DAPCs的高效诱导或反向抑制。常规mRNA或蛋白检测GSK3B,β-catenin,DAPCs标志物（EN1,LMX1A,MSX1）及DANs标志物(TH)的表达。　　结果：Nestin标记流氏分析结果显示，通过改良的底板细胞诱导法能将90%以上的hiPSCs诱导为Nestin阳性的NPCs。RT-qPCR结果显示底板细胞标志物FOXA2、SHH及NETRIN-1的mRNA在底板诱导法得到的NPCs中的表达明显高于第一部分普通神经干细胞诱导法得到的NPCs（p＜0.01）。诱导第8天加入3μM GSK3B抑制剂能引起β-catenin的胞浆内堆积及入核，继续诱导4天后得到的细胞,DAPCs标志物EN1、LMX1A及MSX1的mRNA和蛋白表达明显高于未加抑制剂Chir99021诱导组（p＜0.05）。将DAPCs进一步向神经元分化发现GSK3B抑制剂组DANs分化比例也明显高于未加抑制剂组（p＜0.05）。提示一定浓度的GSK3B抑制剂能够促进FP-NPCs向DAPCs的诱导并进一步实现DANs的高比例分化。β-catenin siRNA沉默实验结果显示，下调β-catenin的表达，能够减少其胞浆内堆积及入核效应。这一效应能明显显降低DAPCs标志物EN1、LMX1A及MSX1的mRNA和蛋白表达（p＜0.05），进一步的分化实验结果显示β-catenin siRNA沉默组DANs分化比例明显低于对照组。提示β-catenin在特定时期的胞浆内堆积及入核效应能明显提高DAPCs标志物的表达并进一步促进DANs的分化。　　结论：通过添加适当浓度的TGF/β及BMP双抑制剂、SHH蛋白、SHH激动剂及FGF8能实现hiPSCs向FP-NPCs的高效诱导。β-catenin的堆积入核效应能实现FP-NPCs向DAPCs的高效转化，并进一步促进DANs的分化。　　第三部分 Mir-135a-5p调节经典Wnt信号通路促进hiPSCs源性FP-NPCs向DA能神经元的诱导分化　　目的：通过调节miR-135a-5p的表达实现hiPSCs来源的FP-NPCs向DAPCs的高比例转化，进而促进DANs的分化。　　方法:Mir-135a-5p靶基因GSK3B的双荧光素酶验证实验。构建has-miR-135a-2慢病毒载体，用has-miR-135a-2慢病毒转染hiPSCs来源的FP-NPCs，检测DAPCs标志物的表达及DANs的分化情况。Mir-135a-5p mimic、NC及inhibitor转染hiPSCs来源的FP-NPCs检测DAPCs标志物的表达及DANs的分化情况。　　结果:双荧光素酶报告基因法验证结果显示GSK3B为miR-135a-5p的靶基因。Has-miR-135a-2病毒转染结果显示持续过表达miR-135a-5p能够实现DAPCs的高效诱导，其中DAPCs标志物EN1和MSX1的表达明显上调（p＜0.05），但免疫荧光结果显示TH阳性的DANs数量在慢病毒转染组相对于未转染组反而下降（p＜0.05），TH的WB蛋白定量检测结果显示出相似的结果。Mir-135a-5p mimic瞬转实验结果显示,在特定时间段内上调miR-135a-5p的表达能够提高DAPCs的转化比例，并进一步实现DANs分化比率的上调;Mir-135a-5p inhibitor瞬转实验结果显示,在特定时间段内下调miR-135a-5p的表达，DAPCs的转化率下降，DANs的分化率也降低。　　结论:Mir-135a-5p过表达能够引起β-catenin的胞浆内堆积入核，并进一步实现DAPCs的高效转化，这一效应可能是通过靶向GSK3B而实现的。但持续过表达miR-135a-5p未能实现DANs分化效率的提高，而瞬时过表达miR-135a-5p能够实现DANs的高效分化，提示在hiPSCs向DANs的分化过程中有存在miR-135a-5p经典Wnt信号-DAPCs-DANs调节环，但该环路式调控效应可能具有时空特异性。　　小结：　　1.简单的单层贴壁培养法，N2/B27诱导培养基能将超过60%的hiPSCs诱导为NPCs，该类NPCs能够进一步分化为TUJ1和MAP2阳性的神经元。hiPSCS,hiPSCs-dNPCs及hiPSCs-dNs中存在miRNAs的差异表达。miRNAs的表达在hiPSCs向神经类细胞的诱导分化过程中具有时空特异性。其中miR-135a-5p在hiPSCs-dNs中的表达明显高于其在hiPSCs-dNPCs中的表达。　　2.改良的底板细胞诱导培养法能将90%以上的hiPSCs诱导为Nestin阳性的NPCs。底板细胞标志物SHH、FOXA2和Nertin-1的mRNA表达在底板诱导法得到的NPCs中明显高于普通诱导法得到的NPCs。通过适量GSK3B抑制剂Chir99021的加入能有效的提高β-catenin在FP-NPCs胞浆中的表达及入核并实现DAPCs的高效转化及DANs的高比例分化。β-catenin siRNA能降低β-catenin在FP-NPCs胞浆中的表达减少它的入核，该效应能抑制DAPCs的转化效率降低DANs的分化比例。　　3.靶基因预测及双荧光素酶报告基因实验证明GSK3B为miR-135a-5p的靶基因，通过调节miR-135a-5p在FP-NPCs中的表达，能够改变靶基因GSK3B的表达并进一步影响β-cateni在胞浆及胞核内的表达。这一效应能明显改变FP-NPCs向DAPCs的转化效应，进一步影响其向DANs的分化。Mir-135a-2慢病毒转染实验及miR-135a-5p mimic、NC及inhibitor转染实验的对比研究发现，β-catenin介导的经典Wnt信号通路在调节FP-NPCs向DAPCs的转化过程中的作用具有时效性，只有在适当的时间窗对其进行激活或沉默才能实现FP-NPCs向DAPCs的高效转化进而实现多巴胺能神经元的高比例分化。