【摘 要】
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牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）是一种可以刺激机体产生免疫抑制继发引起牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）的主要病原,牛呼吸道疾病每年给养牛业造成较大的经济损失。根据流行病学调查结果显示,BPIV3在我国牛群中流行广泛,目前无特效药治疗,并且现阶段国内对BPIV3的检测
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牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3）是一种可以刺激机体产生免疫抑制继发引起牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex,BRDC）的主要病原,牛呼吸道疾病每年给养牛业造成较大的经济损失。根据流行病学调查结果显示,BPIV3在我国牛群中流行广泛,目前无特效药治疗,并且现阶段国内对BPIV3的检测方法研究仍刚起步,还没有自主研发的灵敏准确的商品化检测试剂盒。BPIV3可通过气溶胶传播,存在着强大的传播力和继发的危害性,因此建立一种经济快速有效的BPIV3检测方法更加关键。本研究通过RT-PCR方法扩增了保守的NP蛋白全序列,经测序后进行进化关系分析及抗原表位筛选,分析表明,NP具有较高的遗传稳定性且抗原性良好。连接至p ET-30a载体,将重组质粒转化至大肠杆菌进行诱导表达,根据SDS-PAGE电泳结果显示重组NP蛋白形式表达为包涵体,该蛋白大小为66 k Da。以纯化后的重组NP蛋白作为包被抗原,建立BPIV3抗体间接ELISA。通过对ELISA反应条件的优化,比较P/N值,选择了以下的反应条件:抗原包被浓度为4μg/m L,37℃条件下孵育1 h后,4℃包被过夜;用含2%BSA的PBST于37℃封闭2 h;一抗血清稀释度为50倍稀释,37℃孵育1 h;酶标二抗稀释度为5000倍,37℃孵育1 h;TMB显色15 min,终止后用酶标仪测定OD450nm。该ELISA检测方法的判定标准为:S/P值≥0.187判定为阳性,S/P值＜0.161判定为阴性。该方法在阳性血清160倍稀释时,仍保持较好的敏感性;其板内和板间的重复性试验的变异系数均小于8%;通过对牛布鲁氏杆菌病、口蹄疫、牛副结核病阳性血清进行检测,结果均为阴性,证明所建立方法不与上述病毒产生血清学交叉反应,具有高度特异性;将建立的ELISA方法与中和试验进行符合率比较,二者符合率为84.5%。利用所建立的BPIV3抗体间接ELISA对2009年至2013年黑龙江省4个规模化牧场牛血清样品进行检测抗体阳性率为28.13～54.17%（44.92%）,对2021年东北部分地区29个规模化牧场牛血清样本进行检测抗体阳性率为36.36～83.33%（63%）,所有参测牧场均存在BPIV3感染。
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