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结直肠癌在全球范围内和中国均有较高的发病率和致死率,起病隐匿,预后较差,严重威胁国民健康。探讨结直肠癌发生发展的分子机制,寻找新的治疗靶点,改善预后对结直肠癌的治疗有重要的意义。Piwi蛋白相互作用RNAs（piRNAs）是近年来发现的一类新型小分子非编码RNA,在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。课题组前期研究表明piRNA-823（piR-823）抑制结肠癌细胞凋亡,影响结直肠癌细胞中线粒体标志蛋白HSP 60及HSP 70的表达。线粒体自噬通路中最经典的是PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,选择性清除受损的线粒体,但piR-823是否参与线粒体自噬的调节尚无报道。许多研究报道线粒体自噬可以参与细胞凋亡的调控,但piR-823是否通过调控线粒体自噬抑制结肠癌细胞凋亡尚未可知。本研究对结肠癌细胞抑制piR-823组及其对照组进行数字表达谱测序（DGE）,分析差异基因表达情况;结合分析相关数据库,分析线粒体自噬相关基因变化;再在体外和体内实验分别探讨piR-823对线粒体自噬及线粒体功能及线粒体功能、剩余量的调控作用,揭示piR-823、线粒体自噬与结肠癌细胞凋亡的内在联系,并探讨piR-823调控线粒体自噬的机制。本研究主要包括以下三部分:第一部分:piR-823对结肠癌细胞线粒体自噬及线粒体功能的影响目的:本部分旨在了解piR-823对线粒体自噬的调节,并观察piR-823对结直肠癌细胞线粒体功能和剩余量的影响。方法:应用piR-823 antagomir（Ant-823）抑制结肠癌细胞HCT116和DLD-1中piR-823的表达。应用DGE测序,结合相关数据库,观察分析piR-823的潜在功能。体外实验,应用荧光探针标记双染技术和Western blot法验证抑制piR-823对线粒体自噬的影响,应用JC-1染色、ATP生成、RT-q PCR、流式细胞术和Western blot检测抑制piR-823对线粒体功能和剩余量的变化。体内实验,构建抑制piR-823的sh RNA慢病毒载体,并稳定感染HCT116,进行裸鼠皮下移植瘤实验,明确piR-823对结直肠癌生长的影响,应用免疫荧光共染和Western blot法检测,观察移植瘤组织线粒体自噬情况及线粒体数量变化。结果:DGE测序及相关数据库分析结果显示,抑制piR-823使线粒体自噬相关基因失调,提示piR-823可能参与线粒体自噬的调控。体外实验中抑制piR-823使溶酶体与线粒体的共定位增加,抑制piR-823使HCT116和DLD-1细胞中PINK1、Parkin、p-S65-Parkin和p-S65-Ub的蛋白水平升高,并促进Parkin的线粒体转位,表明抑制piR-823表达促进PINK1-Parkin介导的线粒体自噬。与对照组相比,抑制piR-823使JC-1红绿荧光的相对比值降低,提示线粒体膜电位下降;抑制piR-823使HCT116和DLD-1细胞中ATP浓度明显降低,表明piR-823对线粒体功能的维持有重要作用。与对照组相比,抑制piR-823后Mito Tracker Red的荧光强度、mt DNA相对含量、线粒体标志蛋白TOM20和COX IV的水平降低,表明抑制piR-823可以使HCT116和DLD-1细胞中线粒体剩余量明显减少。裸鼠皮下移植瘤实验表明,抑制piR-823可以抑制结直肠癌生长。与对照组相比,在LV-sh-piR-823组移植瘤组织中,溶酶体与线粒体共定位的增强,p-S65-Parkin的表达水平明显升高,TOM20与COX IV的表达水平明显降低。这些结果表明抑制piR-823可以在体内促进PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,使线粒体剩余量减少。结论:抑制piR-823可以使线粒体自噬相关基因失调,在体内外促进Parkin的激活及线粒体自噬,并且使线粒体功能失调,剩余量减少。第二部分:piR-823通过调控线粒体自噬维持线粒体功能,抑制结肠癌细胞凋亡目的:本部分旨在探讨piR-823敲低诱导的线粒体自噬对线粒体功能、剩余量及结直肠癌细胞凋亡的调节作用。方法:应用针对线粒体关键蛋白Parkin的小干扰RNA在敲低piR-823的结肠癌细胞中抑制线粒体自噬。应用JC-1染色和Western blot分析,评估piR-823敲低诱导的线粒体自噬对线粒体功能、剩余量的影响。应用TUNEL染色和Annexin V/PI双染检测凋亡细胞比例变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-PARP、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3相对表达量,评估piR-823敲低诱导的线粒体自噬对结直肠癌细胞凋亡的作用,明确piR-823是否通过PINK1-Parkin介导的线粒体自噬调节结直肠细胞凋亡。结果:JC-1染色显示,在HCT116和DLD-1细胞中,与Ant-823+si NC组相比,Ant-823+si Parkin组红绿荧光的相对比例升高,提示抑制线粒体自噬可以抵抗piR-823敲低诱导的线粒体膜电位降低。Ant-823+si Parkin组线粒体标志物TOM20及COX IV的蛋白表达水平较Ant-823+si NC组明显升高,提示线粒体剩余量的增加,表明抑制线粒体自噬可以减轻piR-823敲低诱导的线粒体剩余量的减少。这些结果说明piR-823通过调控线粒体自噬维持线粒体功能及数量。Western blot分析结果显示,与Ant-823+si NC组相比,Ant-823+si Parkin组cleaved-PARP、cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3表达水平均明显降低。TUNEL及Annexin V/PI双染法结果显示,在HCT116和DLD-1细胞中,与Ant-823+si NC组相比,Ant-823+si Parkin组凋亡阳性细胞比例明显降低。这些结果表明抑制线粒体自噬可补救piR-823敲低诱导的HCT116和DLD-1细胞凋亡。结论:在HCT116和DLD-1细胞中,piR-823通过抑制线粒体自噬维持线粒体功能,抑制结肠癌细胞凋亡。第三部分:piR-823通过抑制PINK1降解抑制线粒体自噬目的:本部分研究旨在阐明piR-823调控线粒体自噬的机制。方法:结合DGE测序分析,应用RNA-protein pull-down法和RNA结合蛋白免疫沉淀法（RIP）验证piR-823相互作用蛋白,并在细胞水平对靶蛋白的表达进行研究,阐明其分子机制。结果:DGE分析提示piR-823可能与线粒体自噬关键蛋白PINK1及Parkin存在相互作用。RNA-protein pull-down实验证明piR-823与PINK1存在相互作用,而与Parkin不存在相互作用,RIP实验中anti-PINK1可以体外富集piR-823,进一步证实了二者的相互作用。此外,si PINK1敲低PINK1可以补救piRNA-823敲低诱导的线粒体自噬发生和线粒体数量减少,提示PINK1在piRNA-823敲低诱导的线粒体自噬中发挥重要作用。结合第一部分结果,抑制piR-823使PINK1明显增加,而抑制piR-823后PINK1的m RNA相对含量无明显变化,提示piR-823对PINK1的调控不在转录水平。应用放线菌酮（CHX）抑制HCT116细胞蛋白质合成,发现抑制piR-823使PINK1的半寿期延长。应用蛋白酶体抑制剂MG132干预细胞,发现抑制piR-823可以使PINK1泛素化水平明显降低。这些结果表明,piR-823促进PINK1的泛素蛋白酶体途径降解。结论:piR-823与PINK1相互作用,通过促进PINK1的泛素化来促进其经泛素蛋白酶体途径降解,进而抑制线粒体自噬。