【摘 要】
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目的:探究连翘脂素对非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的药理作用及作用机制,为其开发应用提供科学依据。方法:(1)利用棕榈酸酯(PA)刺激肝细胞建立细胞脂质沉积模型;采用CCK8法筛选有效的造模浓度和给药浓度;(2)BODIPY 493/503和油红О染色检测肝细胞内脂质含量;(3)给予小鼠高脂饲料(HFD)构建NAFLD模型,通过全自
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目的:探究连翘脂素对非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的药理作用及作用机制,为其开发应用提供科学依据。方法:(1)利用棕榈酸酯(PA)刺激肝细胞建立细胞脂质沉积模型;采用CCK8法筛选有效的造模浓度和给药浓度;(2)BODIPY 493/503和油红О染色检测肝细胞内脂质含量;(3)给予小鼠高脂饲料(HFD)构建NAFLD模型,通过全自动生化分析仪测定肝功能,H&E染色和油红О染色观察肝组织形态及脂质沉积情况;(4)免疫荧光法及western blot检测自噬相关蛋白表达水平;(5)m Cherry-GFP-LC3B腺病毒转染AML12细胞,通过共聚焦显微镜检测自噬体和溶酶体的数目;(6)在CQ存在和不存在的情况下,通过western blot检测自噬标志物LC3B-II的转换率来评估自噬通量;(7)Western blot测定TFEB及其下游靶基因的表达情况;(8)RNA干扰敲低TFEB验证其在连翘脂素治疗NAFLD中的作用;(9)Fluo-4/AM检测Ca2+来源;(10)Western Blot及实时荧光定量PCR测定炎症相关因子的表达水平。结果:1.CCK8结果显示,0.4 m M的PA对肝细胞活力无明显影响且可使细胞出现脂质沉积,该浓度为细胞模型最佳造模条件;20μM的连翘脂素对肝细胞活性无明显影响。2.油红O染色和BODIPY 493/503染色结果表明连翘脂素可以减轻肝细胞中的脂质沉积(P<0.05或P<0.01);同时肝细胞内的TG和TC水平也明显降低(P<0.05或P<0.01)。3.PA处理后的肝细胞LC3B-II和p62同时增加(P<0.05或P<0.01),表明肝细胞自噬流阻滞;连翘脂素改善了肝细胞的自噬流,表现在连翘脂素处理后p62蛋白积累减少(P<0.05),而LC3B-II蛋白积累增加(P<0.05)。4.PA抑制了肝细胞内的溶酶体生物发生,导致溶酶体数量减少,自噬流阻滞;连翘脂素处理后,溶酶体数量增加,促进自噬溶酶体的形成,改善受损的自噬通量。5.PA抑制了肝细胞内TFEB的核易位,从而破坏了溶酶体的生物发生;连翘脂素处理后TFEB-自噬溶酶体途径被激活,去磷酸化的TFEB转移到细胞核中,从而促进溶酶体的生物生成。6.连翘脂素通过诱导内质网Ca2+释放,触发钙调神经磷酸酶依赖性的TFEB核易位,增强自噬,从而改善非酒精性脂肪肝。7.PA激活NLRP3炎症小体,诱导炎症因子释放;连翘脂素通过负调节自噬抑制炎症反应。8.与ND组相比,高脂饮食显著增加了小鼠的体重、肝重(P<0.05或P<0.01),肝脂肪变性增加,存在较为明显的肝功能损伤、血脂异常和炎症;连翘脂素处理后小鼠体重降低(P<0.05),肝脏颜色恢复红润,肝组织中脂质积累减少,肝功能明显改善,炎症减少;TFEB敲除后,连翘脂素对NAFLD小鼠的改善作用被大大削弱。综上所述,连翘脂素通过调节肝细胞中的Ca2+-钙调神经磷酸酶-TFEB轴来恢复脂质自噬并进一步抑制脂肪变性和炎症。
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