研究背景:　　 硬皮病是一种以皮肤和内脏胶原纤维进行性硬化为特征的结缔组织病。本病病因尚不清楚，目前主要有免疫学说、胶原合成学说和血管学说等。迄今为止，硬皮病仍无有效的防治措施。基因治疗作为一门新兴的学科，其研究进展非常迅速。目前，基因治疗在遗传性疾病、心血管疾病和肿瘤等多种病种中都取得了喜人的成绩，已被批准的基因治疗方案有百例以上。在国外，脂质体介导人肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor，hHGF)基因治疗硬皮病已经在实验室初步获得成功。该研究结果证实HGF对于改善硬皮病的皮肤硬化切实有效。但是脂质体介导的基因转移，外源治疗性基因和宿主细胞的基因组不发生整合，只能够短暂发挥作用。在人类基因治疗的临床实施中，只有稳定表达外源治疗性基因的细胞在病人体内才能产生治疗效果。　　 如何有效地将外源治疗性基因导入受体细胞，是基因治疗研究中的一个重要环节。尽管目前已有多种基因载体可供选择，在人类基因治疗的实施中，一般多选用病毒载体。与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，慢病毒载体(1entiviral vectors，LVs)能够有效地感染并整合到分裂细胞和非分裂细胞中，外源基因表达持续且稳定，具有鲜明特色。近些年来，随着安全性设计的发展，尤其是在HIV-1基础上改造而成的“自灭活”慢病毒的出现，大大降低了LVs潜在的生物学风险，使其在基因治疗中的应用也逐渐得以扩展。在国外，LVs已被批准在基因治疗某些感染性疾病和遗传性疾病等的临床实施方案中使用。　　 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。MSCs免疫原性低，能够向损伤部位迁移，分泌多种生物活性分子或向损伤细胞分化，发挥组织再生和修复等功能。MSCs还可以影响结缔组织中的胶原代谢，产生抗纤维化的效应。目前，用MSCs移植尝试治疗肺脏、肾脏和肝脏纤维化的动物实验都已经获得成功。另外，已有的实验和临床研究证明，MSCs还具有免疫抑制和抗炎效应。因此，针对硬皮病存在自身免疫和以纤维化病变为主，MSCs移植可以成为今后研究硬皮病治疗方案的一个方向。　　 除外MSCs的以上生物学特性，MSCs还易于整合外源基因，可以在体外和体内长期表达相应产物，且不影响其干细胞特性，使其在基因治疗中的应用更为广泛。HGF可以促进MSCs向损伤部位迁移，增强组织再生和修复。基于HGF和MSCs的协同作用，可以预期，将稳定表达HGF基因的MSCs回输硬皮病动物模型体内将会发挥更大的治疗效应。目前，体内和体外研究表明，LVs可以有效地介导MSCs整合外源治疗性基因，而且不影响其生物学特征。因此，在用HGF基因修饰的MSCs移植治疗硬皮病的研究方案中，LVs是合适的基因载体。　　 大量研究表明，骨髓、外周血和脂肪等多种组织中均存在MSCs，以骨髓来源的MSCs研究较成熟。近年来，研究者们在皮肤真皮组织中成功分离MSCs。皮肤是人体最大的器官，且取材方便，出于安全性和伦理学的考虑，真皮组织是MSCs的又一重要来源途径。　　 综上所述，HGF基因修饰的MSCs移植是硬皮病基因治疗研究中一个可供选择的新方案。LVs介导hHGF基因在大鼠真皮间充质干细胞(rat dermis MSCs，rdMSCs)稳定表达的实验将为硬皮病的基因治疗提供基础。　　 研究目的:　　 1.慢病毒载体在体外培养的大鼠真皮间充质干细胞中的基因转移效率；　　 2.慢病毒感染后，人肝细胞生长因子基因在体外培养的大鼠真皮间充质干细胞中的表达情况；　　 3.人肝细胞生长因子基因转移是否改变体外培养的大鼠真皮间充质干细胞的增殖特性。　　 研究方法:　　 根据MSCs的黏附特性采用酶消化法分离新生大鼠真皮来源的MSCs，通过细胞贴壁，传代培养进行筛选。取第3代(P3)细胞进行鉴定，包括流式细胞术分析多种细胞表面分子(CD34、CD44、CD45和CD90)和油红O染色检测细胞体外诱导成脂肪分化的潜能。hHGF-GFP-LVs以不同感染复数(multiplicity ofinfection,MOI)感染P3细胞，荧光显微镜下观察荧光表达，通过GFP荧光阳性细胞计数估计慢病毒的基因转移效率，从而确认多少的MOI是合适的。在MOI为100的条件下，hHGF-GFP-LVs和NC-GFP-LVs(阴性对照组)分别感染P3细胞。慢病毒感染以后，细胞每4天传代培养，分别收集两组P4、P6和P8细胞的培养上清。将标本放于-20℃，密封保存。酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清的hHGF水平。此外，收集第1、2、3、4、5、6天转染rdMSCs和未被转染rdMSCs(空白对照组)，利用台盼蓝拒染法进行细胞计数，分别绘制两组细胞的细胞生长曲线，从而分析hHGF基因转移是否改变rdMSCs的增殖特性。　　 统计学方法:　　 1.定量资料选择算术均数±标准差(x±s)描述；　　 2.重复测量定量资料的比较采用方差分析；　　 3.检验水准以P＜0.05为差异有统计学意义；　　 4.实验数据采用SPSS11.0软件进行统计学分析。　　 结果:　　 1.体外培养rdMSCs是贴壁细胞，有较强的增殖能力，呈克隆性生长。传代培养至第3代，细胞形态较均一，以梭形为主；细胞表面分子流式细胞仪分析结果：CD44和CD90阳性细胞分别占99.3％和99.9％，造血细胞的表面标志CD34和CD45阳性率仅为1.1％和1.6％；细胞经成脂肪诱导体系培养14天，部分细胞的胞浆中可见脂滴，油红O染色阳性。　　 2.hHGF-GFP-LVs表达较慢，感染后72-96小时，GFP基因表达才达到高峰。慢病毒的感染效率与MOI具有量效关系。提高MOI值，可以增加病毒的感染效率。MOI为100时，LVs的基因转移效率能够达80％以上。　　 3.转染rdMSCs的细胞上清hHGF水平高于阴性对照组(F=3229.386.P＜0.05)。hHGF-rdMSCs组P4、P6和P8细胞的培养上清hHGF水平的差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 4.转染rdMSCs与空白对照组在不同时间点的细胞计数的差异无统计学意义。两组细胞的细胞生长曲线相似，均呈“S”形，转染rdMSCs仍有较强的增殖能力。　　 结论:　　 1.在体外培养的大鼠真皮间充质干细胞中，慢病毒载体的基因转移效率高；　　 2.慢病毒载体可以介导hHGF基因在体外培养的大鼠真皮间充质干细胞中稳定表达，且不影响细胞的增殖特性。