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脯氨酰内肽酶(Prolyl Endopeptidase,PEP)是一种能特异性水解小分子多肽中脯氨酸羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶,在食品、发酵、医药、啤酒生产等行业有着非常重要的作用。然而,目前脯氨酰内肽酶的蛋白表达量较低,不能适应大规模的工业化应用。本文在实验室前期开发获得具有自主知识产权的米曲霉脯氨酰内肽酶的基础上,利用融合表达实现该米曲霉脯氨酰内肽酶基因在毕赤酵母中的高效表达,并对融合蛋白进行分离纯化以及酶学性质测定,通过7 L发酵罐扩大培养进一步提高了米曲霉脯氨酰内肽酶的表达水平,并研究了该酶对啤酒酵液非生物稳定性的影响。主要研究成果如下:(1)以紫红色链霉菌磷脂酶PLA2,纤维素结构域(CBD),泛素相关的小标签调节器(SUMO),麦芽糖结合蛋白(MBP)作为融合标签,构建四种融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-SLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-CLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-MLMH,GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH,连同出发菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH,用荧光定量PCR方法鉴定目的基因拷贝数,分别筛选出5拷贝的阳性克隆菌株进行摇瓶发酵,比较它们在发酵过程中的菌体浓度,蛋白浓度及酶活。结果显示,相较于出发菌株,四种融合蛋白的酶活分别提高了2.7,3.8,4.9,7.4倍。借助western blot方法对五种菌株胞内胞外PEP蛋白进行了鉴定。同时,对出发菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-MOH和融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH在转录水平进行比较,结果表明在mRNA转录水平上,融合表达菌株是出发菌株的2.3倍。SDS-PAGE与质谱鉴定结果显示,脯氨酰内肽酶在分泌表达过程中,发生了蛋白的自切割效应。(2)研究了表达量最高的融合蛋白PLMH的酶学性质,并与初始蛋白MOH进行比较。经纯化后,酶学性质研究表明,PLMH及MOH最适温度均为40°C,温度稳定性方面,当温度低于30°C时,稳定性较好,当温度达到45°C时,剩余酶活几乎为零;PLMH与MOH两者最适pH均为5.5,pH稳定性方面,pH在5.0-8.0之间稳定性较好。此外,PLMH的Km,kcat,kcat/Km分别为0.23±0.01 mM,112.51±0.02 s-1,489.17s-1 mM-1,相比MOH,两者动力学参数较为相近。(3)将融合表达菌株GS115/pPIC9K/pPICZαA-PLMH进行7 L发酵罐高密度发酵,发酵条件为起始诱导OD600为110,甲醇诱导浓度1 g?L-1。诱导96 h时结束发酵。发酵结果显示,最高酶活出现在78 h,为960 U?L-1,最高蛋白浓度0.28 mg?mL-1,最高OD600660。(4)通过在啤酒后酵液中添加不同浓度的PLMH研究脯氨酰内肽酶对啤酒后酵液非生物稳定性的影响,与空白对照相比,脯氨酰内肽酶不仅能降低啤酒发酵液中敏感蛋白的含量,同时还能提高啤酒后酵液在贮存期间的非生物稳定性。