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猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）属于α冠状病毒属成员,它是引起猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）的病原体,猪一旦感染此病毒,便会引起严重的腹泻,呕吐等症状,此病的致死率极高。I型干扰素是重要的天然免疫抗病毒因子,在保护机体免受病毒伤害的过程中发挥重要作用。但PEDV抑制干扰素的产生,导致病毒在宿主细胞内大量复制。已有研究表明PEDVNsp15蛋白可以抑制IFN-β的产生。目前为止,PEDVNsp15蛋白在I型干扰素信号通路中的作用还没有报道。本论文探究PEDVNsp15蛋白在此信号通路的作用。利用primer5软件设计其上下游引物,RT-PCR实验技术获取PEDVNsp15基因片段,利用重组克隆技术将目的基因与真核表达载体p CMV-Myc相连,得到的重组载体命名为p CMV-Myc-Nsp15。空载体p CMV-Myc与重组载体p CMV-Myc-Nsp15分别转染到IPEC-J2细胞中,经poly（I:C）刺激,收集全部的RNA,应用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测细胞IFN-β/ISGs m RNA转录水平以及IRF3蛋白的核转运情况。发现PEDVNsp15蛋白以剂量依赖性方式下调IFN-β/ISGs m RNA的转录水平,并且还抑制poly（I:C）所介导IRF3的核转运。这些结果表明,PEDVNsp15蛋白是通过阻断IRF3/IFN-β/ISGs,实现抑制poly（I:C）介导的I型干扰素信号通路。RNA病毒入侵机体时,RLR样受体首先识别病毒的RNA,继而激活下游的信号通路,促进I型干扰素信号向下游传递。为了探究PEDVNsp15蛋白是否通过抑制RIG-I信号通路阻碍I型干扰素信号向下游的传递。首先将重组载体p CMV-Myc-Nsp15、载体p CMV-Myc分别与RIG-I信号通路中的关键蛋白RIG-I/MAVS/IRF3共转染至IPEC-J2细胞中,应用RT-PCR技术检测细胞中IFN-β/ISGs m RNA的转录水平。结果显示,当PEDVNsp15蛋白与MAVS/IRF3共转染时,可下调上述抗病毒因子的转录水平。应用Western blot和RT-PCR实验技术检测出PEDVNsp15蛋白可下调MAVS/IRF3的蛋白表达以及基因转录水平。Co-IP实验表明,PEDVNsp15蛋白与RIG-I/MAVS/IRF3这三种蛋白均不存在相互作用关系。以上实验结果表明,PEDVNsp15蛋白通过下调RIG-I信号通路中MAVS/IRF3的基因转录以及蛋白表达,抑制I型干扰素信号向下游的传递。由于JAK-STAT信号通路也参与免疫反应的发生,I型干扰素激活此通路,致使p-STAT1、p-STAT2、IRF9聚集成ISGF3蛋白复合体进入到细胞核中,促使细胞产生大量的抗病毒因子,从而介导免疫反应的发生。为了探究PEDVNsp15蛋白是否对JAK-STAT所介导的I型干扰素信号通路具有抑制作用。本实验将载体p CMV-Myc与重组载体p CMV-Myc-Nsp15分别转染至IPEC-J2细胞中。经IFNα2b刺激细胞后,收集全部的RNA,利用RT-PCR实验技术检测细胞ISGs m RNA的转录水平,实验结果发现PEDVNsp15蛋白以剂量依赖性方式抑制上述细胞因子的转录,说明PEDVNsp15可作为I型干扰素的拮抗剂。Western blot与Co-IP实验结果显示,PEDVNsp15蛋白抑制STAT1与STAT2的磷酸化,对IRF9蛋白表达没有影响。并且PEDVNsp15蛋白与上述三种关键蛋白均不存在互相作用。综合以上研究表明,PEDVNsp15蛋白可在IPEC-J2细胞中表达,可剂量依赖性下调IFN-β/ISGs m RNA的转录水平。PEDVNsp15蛋白可通过阻碍IRF3蛋白入核从而抑制IFN-β/ISGs m RNA的转录。PEDVNsp15蛋白下调RIG-I信号通路中外源MAVS、IRF3关键蛋白的表达以及基因转录水平影响I型干扰素信号向下游传递。PEDVNsp15蛋白抑制JAK-STAT信号通路中STAT1与STAT2蛋白的磷酸化,阻碍I型干扰素信号通路的转导。