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心血管疾病是引起人类死亡率最高的疾病之一。当心肌细胞缺氧或者缺血时,就会导致心肌坏死,并且坏死的心肌细胞将会被胶原疤痕组织所替代,使得心室发生重构,心脏功能下降,最终诱发心力衰竭或者心肌梗死。现有的药物治疗、溶栓治疗和外科手术治疗等治疗方法只能改善心室重构,保护剩余的心肌细胞,不能修复损伤部位的组织以及增加心肌细胞的数量。有研究者发现,某些诱导因子能够使心肌细胞重新进入细胞周期,恢复心肌细胞的增殖能力,从而使得损伤的心肌组织再生。这为治疗心肌损伤提供了重要思路。本课题组自主研发了重组蛋白IGF1-24,在前期的实验中研究发现重组蛋白IGF1-24能显著促进心肌细胞H9C2增殖,推测其可能对心肌损伤具有修复作用。本论文拟在动物水平上研究其是否对SD大鼠心肌损伤具有修复功能,并初步探索其中的机理,为将其研发成为一种药物提供研究基础。本论文做了以下几个方面的研究:首先,构建PET-32a-IGF1-24的质粒,在表达载体中诱导重组蛋白IGF1-24表达,并且纯化及验证该重组蛋白。其次,通过给大鼠注射异丙肾上腺素构建心肌损伤模型,检测心肌肌钙蛋白T以及组织病理切片染色,确定大鼠心肌损伤模型构建是否成功。再次,注射重组蛋白IGF1-24,检测重组蛋白的心肌修复效果。最后,初步研究重组蛋白的作用机理。本论文中主要的实验内容和结果如下:(1)带PET-32a-IGF1-24质粒的表达载体,在温度为16℃,IPTG浓度为0.6mM,时间为6h的条件下,诱导重组蛋白IGF1-24表达。将超声破碎的菌体加入到Ni琼脂糖蛋白纯化柱,分离纯化得到目的蛋白。目的蛋白用Western blot验证之后,确定所得到的蛋白是重组蛋白IGF1-24,浓度约为0.2mg/mL。(2)SD大鼠连续7天腹腔注射浓度为80mg/kg的异丙肾上腺素之后,明显地观察到大鼠的体征变化。大鼠的体重增长明显变缓慢并且大鼠血清中心肌肌钙蛋白T浓度明显升高。HE染色结果图显示,大鼠的心脏组织受损,心肌细胞被破坏。由此可见,成功构建心肌损伤模型。(3)按100μg/kg连续7天尾静脉注射重组蛋白IGF1-24之后,观察到大鼠体重增长值增加,血清中cTn T的浓度减小,并且HE染色结果表明大鼠心肌组织受损程度缓解。实验结果证实重组蛋白IGF1-24对心肌损伤有修复作用。(4)本文初步探讨了重组蛋白IGF1-24治疗心肌损伤的作用机理。EDU检测细胞增殖发现IGF1-24能够诱导心肌细胞恢复增殖能力,从而修复损伤的心肌组织。通过TUNEL染色和免疫荧光检测,发现重组蛋白IGF1-24治疗后能够减少心脏组织中细胞的凋亡和炎症因子IL-6、TNF-α分泌。本实验研究了重组蛋白IGF1-24在心肌损伤修复中的作用,结果表明其能够修复损伤的心肌组织。其可能的作用途径为诱导心肌细胞增殖,减少细胞凋亡以及炎症因子分泌。这为将重组蛋白IGF1-24研发成为一种药物提供了研究基础。