恐惧是一种由现实或想象中的威胁诱发的情绪行为,是人类情感的正常组成部分。适度的恐惧反应能警示动物面对类似于先前经历的有害环境,及时评估潜在的危险并做出保护反应,而病理性恐惧记忆的产生将会导致创伤后应激综合征（posttraumatic stress disorder,PTSD）、惊恐障碍（panic disorder）、恐惧症（phobia）等恐惧相关疾病。流行病学研究显示,普通人群PTSD的终生患病率约为5%-10%,曾遭受创伤事件（如战争）的特定人群PTSD的患病率高达10%-40%。近年来,随着突发事件的增加,PTSD等恐惧相关疾病的发生率明显增加,给个人、家庭及社会带来沉重的负担。然而,恐惧相关疾病的治疗仍面临巨大挑战。一方面,恐惧记忆获得极快,可以长期稳定存在,并且容易泛化;另一方面,目前临床采用的基于恐惧消退原理的暴露疗法仍存在众多缺陷,如起效慢,治疗效果有限,且疗效不能维持等。因此,研究病理性恐惧记忆消退机制对PTSD等恐惧相关疾病的治疗具有重要意义。基于巴甫洛夫条件反射原理建立的经典的条件性恐惧（Cued-fear conditioning）以及在此基础上发展出的背景关联恐惧（Contextual fear conditioning）是最常见研究恐惧相关疾病的动物模型,广泛应用于恐惧学习和记忆的神经、分子机制研究。海马是大脑边缘系统结构之一,在情感和认知功能中具有重要作用。既往研究表明,海马与PTSD发生、发展及治疗密切相关,其中包含海马CA3、DG的三突触通路对于背景关联型恐惧记忆至关重要。然而,海马在恐惧记忆消退中的作用及神经、分子学机制所知甚少。神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）是中枢神经系统中主要的NO合酶,在脑边缘系统中大量表达,参与调控多种情感和认知行为。药理学及遗传学研究发现,nNOS及NO信号通路在恐惧记忆的形成和消退中扮演重要角色。nNOS N-端的PDZ（post-synaptic density protein discs-large,ZO-1）结构域可以与突触后密度蛋白95（post-synaptic density protein 95,PSD-95）结合形成复合蛋白nNOS-PSD-95。PSD-95是谷氨酸能突触后密集区的核心脚手架蛋白,连接突触后膜受体蛋白与胞内蛋白,介导谷氨酸能突触可塑性,对突触功能、树突棘发生、生长等起调控作用,与阿尔茨海默症、精神分裂症、亨廷顿病以及PTSD的发生密切相关。研究表明,PSD-95是恐惧记忆形成、稳定及消退过程的一个关键调节分子。另外,N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）受体介导的突触可塑性是恐惧记忆消退的核心机制,我们实验室研究发现,NMDA受体激活诱导nNOS-PSD-95耦联,那么nNOS-PSD-95相互作用可能在调节恐惧记忆消退中起重要作用。为证明此推测,本课题设计两部分研究内容:1)研究nNOS-PSD-95耦联在恐惧记忆消退中的作用;2)探讨NOS-PSD-95耦联调控恐惧消退的分子机制。第一部分我们采用背景关联型恐惧记忆模型进行恐惧消退训练,结果发现背景关联型恐惧消退后背侧海马nNOS-PSD-95耦联水平显著下降。恐惧记忆检测后立即腹腔注射nNOS-PSD-95耦联阻断剂ZL006,在消退训练前预先给药7d,其后在每次消退训练后立即给药,显著加快条件性恐惧和背景关联型恐惧消退。为了明确阻断nNOS-PSD-95耦联作用于恐惧消退的具体阶段,我们分别在消退训练前连续7d预先给予ZL006,或每次消退训练后立即给予ZL006,进行行为学检测。结果显示,仅在消退训练前给予ZL006显著促进背景关联型恐惧消退,而在消退训练期间给予ZL006并不影响恐惧消退。说明阻断nNOS-PSD-95耦联抑制消退记忆的获得。另外,在恐惧训练前,腹腔注射ZL006,并不影响两种恐惧记忆获得。为了进一步研究海马调控恐惧消退的关键亚区,我们通过微量给药系统,分别在背侧海马CA1、CA3、DG区阻断nNOS-PSD-95耦联,观察对恐惧消退的作用。行为学检测发现,采用背景关联型恐惧记忆模型,在海马CA3区给予ZL006、解耦联多肽Tat-nNOS_1-133,以及构建重组病毒LV-nNOS_1-133-GFP阻断nNOS-PSD-95耦联,均显著加快背景关联型恐惧消退。在nNOS-/-小鼠CA3区给予ZL006,对背景关联型恐惧消退的促进作用消失。而在CA1或DG区给予Tat-nNOS1-133或ZL006并不影响背景关联型恐惧记忆消退。另外,在CA3区给予LV-nNOS1-133-GFP不影响背景关联型远期恐惧记忆的消退。采用条件性恐惧记忆模型,在小鼠CA3区给予ZL006同样显著加快条件性恐惧消退。结果说明,海马CA3区nNOS-PSD-95耦联调控恐惧记忆的消退,阻断CA3的nNOS-PSD-95耦联显著促进恐惧记忆消退。第二部分我们采用背景关联型恐惧记忆模型,初步探讨了阻断nNOS-PSD-95耦联促进恐惧消退的分子机制。蛋白免疫印迹分析（Western blot,WB）结果显示,背景关联型恐惧消退训练显著上调背侧海马BDNF表达水平。消退训练前,在背侧海马CA3区给予LV-nNOS_1-133-GFP或连续四天给予ZL006,行为学检测发现在消退训练第一（E1）或（E2）,阻断nNOS-PSD-95耦联显著加快恐惧消退。于E1（ZL006）或E2(LV-nNOS_1-133-GFP)后1h取CA3组织进行检测。WB结果显示,阻断nNOS-PSD-95耦联显著增加BDNF表达。同样实验方案,在nNOS-/-小鼠CA3区给予ZL006对BDNF表达无影响。为了证明BDNF确实是其机制,采用微量给药系统,在消退训练过程中于CA3区给予BDNF清除剂TrkB-FC,行为学检测发现,TrkB-FC完全逆转LV-nNOS_1-133-GFP对恐惧消退的促进作用。另外,给予特异性TrkB受体拮抗剂ANA-12,阻断BDNF下游信号通路,与TrkB-FC作用一致,行为学结果显示,ANA-12逆转了LV-nNOS_1-133-GFP对恐惧消退的促进作用。以上结果说明,BDNF上调介导nNOS-PSD-95解耦联对背景关联型恐惧记忆消退的促进作用。HDAC2通过表观遗传学机制调控BDNF表达,而我们实验室前期研究发现nNOS-PSD-95解耦联能调控HDAC2表达和活性。因此,我们还进一步研究了HDAC2是否参与BDNF介导的nNOS-PSD-95耦联对恐惧记忆消退的调控。蛋白免疫印迹分析（Western blot,WB）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）结果显示,背景关联型恐惧消退训练显著下调HDAC2表达。采用与BDNF相同的研究方式,发现给予ZL006阻断nNOS-PSD-95耦联显著抑制HDAC2表达。同样实验方案,在nNOS-/-小鼠CA3区给予ZL006,WB及免疫荧光检测发现,对nNOS-/-小鼠CA3区HDAC2表达无影响。为了明确HDAC2在恐惧消退中的重要作用,我们采用重组病毒AD-HDAC2-flag过表达CA3区HDAC2,与对照组给予无活性片段（AD-HDAC2（7989-1）-flag）相比,不仅逆转ZL006对恐惧消退的促进作用,且消退水平显著低于溶剂对照组。以上结果表明,海马CA3区HDAC2下调介导nNOS-PSD-95解耦联对背景关联型恐惧记忆消退的促进作用。综上所述,海马CA3区nNOS-PSD-95蛋白相互作用负调控恐惧记忆消退;HDAC2下调和BDNF上调共同参与nNOS-PSD-95解耦联对恐惧记忆消退的促进作用。