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研究目的失血性休克常见于创伤和大手术,可以造成缺血/再灌注类型的损伤。失血性休克患者在接受二次打击如感染时,更易发展为系统性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome,MOF）。研究表明失血性休克可以通过预激活固有免疫系统,放大炎症反应,导致组织、器官损伤,然而其具体机制未明。并且在失血性休克的发展过程中巨噬细胞与中性粒细胞间的相互作用并不清楚,越来越多的研究表明外泌体可以介导细胞间的交流。我们通过对失血性休克过程中巨噬细胞对中性粒细胞死亡调控的研究,以探索失血性休克的发展机制,以期改善对手术、创伤病人致失血性休克的临床干预。研究方法1.体内实验采用失血性休克模型,将C57BL/6野生型、gp91基因敲除型小鼠随机分为假手术组（Sham组）、失血性休克组（HS组）。对Sham组小鼠不抽取血液、不进行复苏,其余实验步骤与HS组相同。为了研究肺泡巨噬细胞对中性粒细胞死亡的作用,在失血性休克前24小时于气管内注射Clodrosme以清除肺泡巨噬细胞。复苏8小时后,处死小鼠,实施肺泡灌洗,进行后续实验。2.体外实验采用低氧/复氧培养条件下巨噬细胞与中性粒细胞共培养模型。低氧条件为在1%O2下培养15小时,在21%O2下培养5小时。对照组即为在21%O2下培养20小时。巨噬细胞与中性粒细胞均从小鼠骨髓提取,巨噬细胞在体外培养成熟后与中性粒细胞按1:1比例共培养。3.采用流式细胞术检测小鼠肺泡灌洗液中和体外共培养后中性粒细胞7-AAD和Annexin V双阳性细胞所占的比例;用激光共聚焦显微镜检测中性粒细胞内RIPK1与RIPK3共定位情况;通过Western-Blot检测中性粒细胞内RIPK1与MLKL磷酸化情况。以上检测方法联合使用可以判断中性粒细胞是否处于坏死状态。4.采用外泌体分离试剂盒（培养基专用）分离细胞培养基中的外泌体。用NTA检测外泌体的大小,Lowry法对外泌体中蛋白进行定量,流式细胞术检测外泌体标志物CD63的表达情况,电镜下观察外泌体的典型形态。研究结果1.在失血性休克模型中巨噬细胞促进中性粒细胞坏死。与假手术组（Sham组）相比,失血性休克组（HS组）肺泡灌洗液中性粒细胞7-aad和annexinv双阳性所占的比例明显升高（p<0.01）。clodrosome气管内注射后（clodrosome-hs组）肺泡灌洗液中中性粒细胞7-aad和annexinv双阳性所占的比例较hs组明显降低（p<0.01）。通过激光共聚焦显微镜同样检测到hs组肺泡灌洗液中中性粒细胞内ripk1与ripk3共定位明显增多;clodrosome清除肺泡巨噬细胞后,中性粒细胞内ripk1与ripk3共定位相较于hs组减少（p<0.01）。2.在低氧/复氧模型中巨噬细胞促进中性粒细胞坏死。在低氧条件下与巨噬细胞共培养组（hypoxia+mφ组）中性粒细胞7-aad和annexinv双阳性所占的比例较其它组明显增高（p<0.01）,ripk1抑制剂nec-1可以抑制hypoxia+mφ组中性粒细胞坏死的增加（p<0.01）。westernblot检测到hypoxia+mφ组中性粒细胞内出现明显的ripk1磷酸化条带。通过激光共聚焦显微镜可以看到hypoxia+mφ组中性粒细胞内ripk1与ripk3共定位增加（p<0.01）。3.在失血性休克模型中巨噬细胞释放外泌体增加。用流式细胞术检测肺泡灌洗液中外泌体标志物cd63平均荧光强度（mfi）。与假手术组（sham组）相比,失血性休克组（hs组）mfi明显增高（p<0.01）;清除肺泡巨噬细胞后,外泌体含量较hs组减少（p<0.01）。通过透射电镜可以观测到外泌体的双层膜结构。4.在体外低氧/复氧模型中巨噬细胞外泌体分泌增加。用纳米颗粒分析系统（nta）检测我们自培养基中分离的外泌体,其平均直径为39.86nm,占全部分离颗粒的85%。低氧培养条件下巨噬细胞分泌外泌体内蛋白含量为正常氧培养条件下的（4.16±0.35）倍（p<0.01）。用流式细胞术检测巨噬细胞外泌体标志物cd63表达强弱,低氧培养条件下巨噬细胞分泌外泌体表达cd63的平均荧光强度（mfi）较正常氧培养条件下明显增高（p=0.009）。且激光共聚焦显微镜下可以观察到中性粒细胞内摄取有巨噬细胞分泌的外泌体。5.外泌体分泌抑制剂能够抑制低氧/复氧过程中巨噬细胞对中性粒细胞坏死的促进作用。外泌体分泌抑制剂dma能够抑制低氧/复氧条件下与巨噬细胞共培养后（hypoxia+mφ+dma组）中性粒细胞7-aad和annexinv双阳性细胞比例的增加,与hypoxia+mφ组相比差异有统计学意义（p<0.01）。westernblot检测到在低氧/复氧条件下与巨噬细胞共培养后,dma可以抑制中性粒细胞内ripk1、mlkl磷酸化。通过激光共聚焦显微镜检测到dma可以抑制低氧/复氧条件下巨噬细胞促进的中性粒细胞内ripk1与ripk3共定位。6.低氧/复氧过程中巨噬细胞释放外泌体促进中性粒细胞坏死。与低氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体共培养组（hypoxia+exos组）中性粒细胞坏死水平较与正常氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体共培养组（Normoxia+Exos组）明显增加,且能为Nec-1所抑制（P<0.01）。7.在低氧/复氧模型中巨噬细胞外泌体上调中性粒细胞内ROS水平。在低氧条件下与巨噬细胞共培养组（Hypoxia+Mφ组）中性粒细胞内ROS水平较其它组明显升高（P<0.01）,且能被外泌体分泌抑制剂DMA所抑制。并且,与低氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体共培养组（Hypoxia+Exos组）中性粒细胞内ROS水平较与正常氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体共培养组（Normoxia+Exos组）明显增加（P<0.01）。8.低氧/复氧过程中巨噬细胞外泌体通过上调中性粒细胞内ROS水平促进其坏死。低氧培养条件下与巨噬细胞共培养时加入ROS清除剂NAC后（Hypoxia+Mφ+NAC组）,中性粒细胞7-AAD和Annexin V双阳性所较Hypoxia+Mφ组明显下降（P<0.01）。WT中性粒细胞与gp91phox-/-巨噬细胞在低氧条件下共培养后,中性粒细胞坏死比例与中性粒细胞是WT型的其它组相比明显升高（P<0.01）。然而,当gp91phox-/-中性粒细胞与WT巨噬细胞在低氧条件下共培养后,中性粒细胞7-AAD和Annexin V双阳性所占的比例与中性粒细胞是gp91phox-/-型的其它组相比差异无统计学意义（P>0.05）。将低氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体与gp91phox-/-中性粒细胞共培养,gp91phox-/-中性粒细胞7-AAD和Annexin V双阳性所占的比例较Hypoxia+Exos组明显下降（P<0.01）。且低氧培养条件下巨噬细胞分泌的外泌体不能上调gp91phox-/-中性粒细胞内ROS水平（与Hypoxia+Exos组相比差异有统计学意义,P<0.01）。9.NADPH氧化酶在失血性休克过程中性粒细胞坏死中具有重要作用。野生型小鼠（Wild Type,WT）失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒细胞7-AAD和Annexin V双阳性所占的比例较gp91phox-/-小鼠明显升高（P<0.01）。WT小鼠失血性休克后肺泡灌洗液中中性粒细胞内RIPK1与RIPK3 Pearson共定位系数较gp91phox-/-小鼠明显升高（P<0.01）。结论失血性休克过程中肺泡巨噬细胞促进中性粒细胞坏死,且巨噬细胞外泌体介导了这一过程。在体外低氧/复氧过程中ROS介导了巨噬细胞外泌体对中性粒细胞坏死的促进作用。NADPH氧化酶在失血性休克过程中性粒细胞坏死中具有重要作用。