背景:强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)为临床常见的慢性炎性脊柱关节病,有较高致残率,多侵犯中轴及骶髂关节,临床多见脊柱及骶髂关节炎以及肌腱韧带附着点炎。炎症是造成AS患者骨破坏和病理性骨化的关键因素,反复的炎症可造成骨侵蚀与异位骨化,导致骨关节融合、僵直,使患者活动受限,严重影响日常生活及工作。因此,控制炎症是延缓AS病程、防止致残的关键。辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)是AS炎症发生的主要效应细胞,通过特征性分泌细胞因子白细胞介素17(interleukin 17,IL-17),诱导促炎介质和趋化因子,介导AS炎症发生。因此,抑制Th17分化,减少IL-17的分泌,是控制AS炎症的重要靶标。Th17细胞由初始CD4+T细胞(Naive CD4+T cell)分化而来,属于CD4+T细胞亚群之一,当外界炎性因子刺激活化Naive CD4+T细胞后,启动Th17细胞分化特征性转录因子维甲酸相关孤儿受体yt(Retinoid-acid receptor-related orphan receptor yt,RORyt)表达,开启向Th17细胞分化偏移过程,且向其他亚群的分化受抑。抑制RORyt转录活化,是抑制Th17分化偏移的关键一步。转录因子RORyt受上游Janus激酶/信号转导子和转录激活因子(JAK/STAT)通路的调控。JAK2/STAT3是参与Th17细胞分化的一条重要通路,受外界IL-23刺激后,JAK/STAT信号通路激活并诱导STAT3发生磷酸化,并以二聚体的形式进入细胞核,与转录因子RORc结合,开启Th17细胞分化;另一方面此二聚体还能与IL-17基因启动子序列的特定位点直接结合,促进IL-17的分泌。因此,抑制JAK/STAT信号通路活化,从而抑制RORyt的转录激活,对控制AS炎症发生具有重要意义。近年来大量研究发现,转录因子RORyt、上游信号分子STAT3与下游效应因子IL-17的编码基因启动子区域存在广泛的组蛋白H3赖氨酸27-三甲基化(Methylation of histone H3 at lysine 27,H3K27me3)标记,H3K27me3 对 Th17的分化偏移起重要调控作用。组蛋白H3是染色体的主要结构蛋白之一,组蛋白H3 的 N-末端赖氨酸残基 K27(methylation of histone H3 at lysine 27,H3K27)是维持基因沉默的关键位点,该位点的甲基化修饰是调控RORc由沉默转向活化的“开关”。当组蛋白H3K27以三甲基化修饰状态存在时,可特异性的招募抑制性复合物,使染色体结构变得紧密,基因维持沉默状态。研究发现H3K27me3可抑制RORyt、STAT3以及IL-17转录激活,当将H3K27me3标记从RORyt、STAT3以及IL-17基因启动子区被移除后,基因转录抑制作用减弱,沉默解除并转向活化,开启Th17细胞分化。因此,组蛋白H3K27me3水平可能是影响AS患者Th17细胞分化偏移的重要调控因素。组蛋白H3K27me3水平受组蛋白去甲基化酶JMJD3与组蛋白甲基转移酶EZH2 共同调控。JmjC 结构域的蛋白家族 3(Jumonji domain-containing protein 3,JMJD3)与 Zeste 同源物增强子 2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是一对作用于组蛋白H3K27位点的一对具有拮抗作用的组蛋白甲基化修饰酶,JMJD3作为组蛋白去甲基化酶能特异性降解H3K27me3,而EZH2通过特异性催化H3K27位点发生三甲基化修饰,抑制基因表达。敲除JMJD3或应用JMJD3小分子抑制剂后的Naive CD4+T细胞几乎不向Th17细胞分化偏移;与之相反,敲除EZH2后的Naive CD4+T细胞则开启向Th17的分化偏移,说明组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2可能通过调控H3K27me3水平,对Th17分化发挥上游调控作用。清热利湿活血法是中医临床治疗AS的常用治法之一,在前期国家十一五科技支撑计划重大疑难病AS研究中,采用清热活血立法组方的清热强脊汤治疗活动期AS,国际ASAS20、50、70判定临床疗效有效率分别可达86.75%、60.68%和41.45%,且清热强脊汤对AS疾病活动度、炎症指标及临床症状均有明显的改善作用。在前期北京市自然科学基金项目中,我们发现清热活血法可抑制Th17分化,发挥抗炎作用。此外,在前期研究中我们发现,AS患者PBMC中存在着高表达的JMJD3以及低表达的EZH2,并且清热活血法可显著降低AS患者PBMC中JMJD3表达水平。基于上述研究结果,我们推测中药对Th17分化的抑制作用,可能是通过影响组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2,从而干预转录因子RORc、JAK/STAT通路信号分子及效应因子IL-17基因启动子区域H3K27三甲基化水平而实现的。雷公藤是具有抗炎、免疫抑制、止痛等功能的祛风湿类药物,雷公藤甲素是中药雷公藤的有效成分之一,在前期研究中,我们发现中药单体雷公藤甲素可抑制AS患者外周血单个核细胞中组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达,或上调组蛋白甲基转移酶EZH2的表达水平,影响Th17细胞的分化及功能。本研究基于此,进一步探究中药单体雷公藤甲素干预组蛋白H3K27me3水平,调控AS患者Th17细胞分化的表观遗传机制。研究一:AS患者Th17分化状况及组蛋白H3K27me3表达水平的研究目的:初步探究AS患者H3K27me3表达水平及其在AS炎症过程中调控Th1 7细胞分化的表观遗传机制;方法:1.纳入来自中国中医科学院广安门医院门诊或住院符合诊断标准的活动期AS患者(AS-Active)30例,稳定期AS患者(AS-Stable)15例。纳入10例健康志愿者为正常对照组(N)。取肘窝静脉血后收集血清,采用Ficoll-hypaque密度梯度离心法分离PBMC,酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组血清IL-17表达水平,研究IL-17水平与炎症指标ESR、CRP及疾病活动指数BASDAI的相关性。2.蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组患者PBMC中H3K27me3表达水平,检测JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达及磷酸化状况,检测特征性转录因子RORc表达状况,并与健康志愿者进行对照。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测 mRNA 表达情况,检测采用 Spearman相关系数进行相关性分析,研究H3K27me3与AS患者炎症活动情况及Th17分化情况的相关性。结果:1.活动期与非活动期AS患者血清IL-17水平均较正常对照组显著增高(p<0.05);活动期AS患者较非活动期患者血清IL-17水平显著增高(p<0.01);且AS患者血清IL-17水平与炎症指标CRP、ESR均呈显著正相关(IL-17-CRP:p<0.05;IL-17-ESR:p<0.05);2.与正常对照组相比,活动期AS患者JAK2蛋白表达水平升高,STAT3蛋白表达量无显著差异(JAK2:p<0.05;STAT3:pp>0.05);与非活动期相比较,活动期AS患者JAK2、STAT3蛋白表达水平虽无显著差异(JAK2:p>0.05;STAT3:p>0.05),但 pJAK2、pSTAT3 表达水平显著增高(pJAK2:p<0.05;pSTAT3:pp<0.01)。非活动期AS患者与正常对照组相比,JAK2、STAT3蛋白表达量无显著差异(JAK2:p>0.05;STAT3:p>0.05),pJAK2 水平无显著差异,pSTAT3水平明显升高(pJAK2:p>0.05;pSTAT3:p<0.05)。活动期与非活动期AS患者RORc mRNA及蛋白表达水平均较正常对照组显著升高(p<0.05),活动期AS患者较非活动期RORc mRNA及蛋白表达水平显著升高(p<0.01)。3.与正常对照组比较,活动期AS患者H3K27me3水平显著降低(p<0.05);与非活动期比较,活动期AS患者H3K27me3水平显著降低(p<0.01);非活动期AS患者较正常组无显著差异。H3K27me3水平与炎症指标CRP、ESR均呈负相关(H3K27me3-CRP:P<0.05;H3K27me3-ESR:pp<0.05),与 RORc 蛋白表达水平呈负相关(p<0.05)。研究二:组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2调控H3K27me3水平影响Th17分化的研究目的:初步探究AS患者组蛋白甲基化修饰酶JMJD3与EZH2的表达情况及其对Th17分化的干预作用;方法:蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测各组患者PBMC中JMJD3、EZH2蛋白表达水平,并与健康志愿者进行对照。实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)检测mRNA表达情况,检测采用Spearman相关系数进行相关性分析,研究JMJD3、EZH2与AS患者炎症活动情况及Th17分化情况的相关性。结果:与正常对照组相比,活动期AS患者JMJD3 mRNA及蛋白表达均明显升高(pp<0.05);与非活动期相比,活动期AS患者JMJD3mRNA及蛋白表达均明显升高(蛋白:p<0.01;mRNA:p<0.05)。非活动期AS患者较正常组无显著差异。与正常对照组相比,活动期及非活动期AS患者EZH2 mRNA及蛋白表达均明显下降(p<0.05);活动期AS患者较非活动期EZH2 mRNA及蛋白表达均明显降低(p<0.05)。经相关性分析后,发现JMJD3表达水平与H3K27me3水平呈负相关(p<0.05);EZH2表达水平与H3K27me3水平呈正相关(p<0.05)。JMJD3表达水平与IL-17、RORc水平均呈正相关(p<0.05);EZH2表达水平与IL-17、RORc水平均呈负相关(p<0.05)。研究三:清热利湿活血法对H3K27me3水平及Th17分化的影响目的:初步探究清热利湿活血法对AS患者PBMC H3K27me3表达水平的影响及对Th17分化的调节作用。方法:观察清热利湿活血法治疗前后AS患者炎症指标及疾病活动度的变化,ELISA法检测中药治疗前后血清IL-17表达水平;Western Blot检测清热利湿活血法治疗前后患者PBMC中H3K27me3表达水平及Th17分化特征性转录因子RORc表达状况。结果:1.经清热活血法治疗3个月后,AS患者炎症指标ESR、CRP较中药治疗前明显下降(ESR:p<0.01;CRP:p<0.05);AS患者疾病活动指数BASDAI较治疗前明显下降(p<0.01);血清IL-17水平较中药治疗前明显下降(p<0.01)。2.经清热活血法治疗3个月后,AS患者H3K27me3表达水平较中药治疗前明显升高(pp<0.01),RORc表达水平较中药治疗前明显下降(pp<0.01)。研究四:清热利湿活血法对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响目的:初步探究清热利湿活血法对AS患者PBMC中组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达水平的影响。方法:Western Blot检测清热利湿活血法治疗前后患者PBMC中JMJD3/EZH2表达水平结果:经清热活血法治疗3个月后,AS患者JMJD3表达水平较中药治疗前明显下降(p<0.01),EZH2表达水平较中药治疗前明显升高(p<0.01)。研究五:中药单体雷公藤甲素对H3K27me3水平及Th17分化的影响目的:观察体外干预中药单体雷公藤甲素对活动期AS患者PBMC H3K27me3表达水平的影响及对Th17分化的调节作用。方法:体外分离培养活动期AS患者PBMC,中药单体雷公藤甲素进行体外干预,以JMJD3的小分子抑制剂GSK-J4为阳性对照组。Cell Counting Kit-8(CCK-8)法及ELISA法确定中药单体雷公藤甲素和GSK-J4的最佳体外干预浓度。观察在最佳药物浓度的作用下,雷公藤甲素对H3K27me3表达的影响及对JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达和磷酸化状况和转录因子RORc表达的影响,具体方法详见“研究一”。结果:1.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)H3K27me3水平较空白对照组均明显升高(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。2.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)均能明显抑制JAK2/STAT3通路信号因子磷酸化水平(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)JAK2、STAT3 mRNA表达水平较空白对照组差异均无统计学意义。3.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)均能明显抑制RORcmRNA及蛋白水平(p<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。研究六:中药单体雷公藤甲素对组蛋白甲基化修饰酶JMJD3/EZH2表达的影响目的:观察体外干预中药单体雷公藤甲素,对活动期AS患者PBMC JMJD3、EZH2表达水平的影响。方法:观察在最佳药物浓度的作用下,雷公藤甲素对JMJD3、EZH2表达的影响及对JAK/STAT信号通路各级信号因子的表达和磷酸化状况和转录因子RORc表达的影响,具体方法详见“实验一”。结果:1.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)JMJD3mRNA、蛋白水平较空白对照组均明显降低(pp<0.05);AS-TP组与阳性对照组比较,差异无统计学意义。2.雷公藤甲素单体干预组(AS-TP)及小分子抑制剂GSK-J4干预组(阳性对照组)EZH2 mRNA、蛋白水平较空白对照组均明显升高(p<0.05);阳性对照组较AS-TP组EZH2水平上升更为明显(p<0.05)。研究结论:1.AS患者PBMC中H3K27三甲基化水平较正常人显著下降,可能是激活Th17特征性转录因子RORc及上游JAK/STAT信号通路,介导AS炎症发生的重要机制之一。2.AS患者组蛋白去甲基化酶JMJD3高表达,甲基转移酶EZH2低表达,使H3K27位点去甲基化,可能是AS炎症发生的主要调控因素之一。3.清热利湿活血法抑制去甲基化酶JMJD3活性,上调甲基转移酶EZH2表达,促进H3K27位点发生三甲基化,从而抑制Th17分化,可能是其缓解AS炎症的机制之一。4.中药单体雷公藤甲素体外干预AS患者PBMC能明显抑制Th1 7特征性转录因子RORc表达及上游JAK2/STAT3信号通路的活化,其作用机制可能是通过抑制去甲基化酶JMJD3活性,上调甲基转移酶EZH2表达,从而促进组蛋白H3K27位点发生三甲基化而实现的。