黑曲霉被广泛应用于商用蛋白的生产,但是针对黑曲霉的遗传操作工具却比较单一化。传统的同源重组系统有着操作简便、适用范围广的特点,但是其效率普遍偏低,因此一套操作简便而且效率高的遗传操作工具亟待开发。黑曲霉具有强大的胞外蛋白分泌能力,但是异源蛋白在黑曲霉中的分泌表达能力却不尽人意。对其限制因素的分析表明,异源蛋白基因的转录以及m RNA稳定性水平总体上是令人满意的,其生产瓶颈主要存在于内质网中蛋白翻译后分泌途径中的修饰过程。磷脂作为内质网的主要成分,对内质网的形态、体积、功能有重要的影响。酿酒酵母中报道过主要调控磷脂代谢的转录因子ino2/ino4除了对磷脂代谢调控有主导作用,进而影响内质网的功能,也会影响内质网蛋白加工稳态环境。然而在黑曲霉中,关于磷脂代谢的转录调控研究得却是少之又少。内质网磷脂稳态失衡会造成脂质双层成分的扰动,进而影响内质网的形态,这种变化可以独立于UPR压力而激活内质网的UPR效应。同时,蛋白分泌途径中UPR信号机制除了作为内质网压力的应答途径,促进控制胞内蛋白质量控制与动态平衡外,UPR调控基因中也包含许多与磷脂代谢相关的功能基因。内质网的蛋白稳态与磷脂代谢稳态有某种内在联系,但是目前在黑曲霉中未见报道。本论文通过发掘黑曲霉自身的U6启动子并结合同源介导修复、体外转录sg RNA的原理,建立了适用于黑曲霉的CRISPR/Cas9基因编辑技术。通过发掘磷脂调控转录因子ino2并对其进行遗传学研究以揭示其对于磷脂合成的调控机制。通过发掘磷脂合成途径的重要基因cho2、opi3和dgk1,并针对以上基因的改造而获得黑曲霉的磷脂失衡菌株Δino2、Δcho2、Δopi3和Δdgk1。通过改造内质网UPR效应基因hac A获得黑曲霉的内质网蛋白稳态失衡株Δhac A(hac A敲除株)以及hac Ai(hac A持续性激活表达株)。基于以上的菌株探究磷脂稳态失衡与内质网蛋白分泌稳态失衡之间的内在关系。具体研究结果如下:(1)基于CRISPR-HDR技术的黑曲霉基因编辑平台的构建首次发掘黑曲霉自身的III型启动子(p An U61和p An U62)并应用于自身的CRISPR/Cas9系统,并且将其与同源介导修复、体外转录sg RNA技术结合起来,建立了高效的CRISPR-HDR系统,其中p An U61和p An U62已经申请专利并授权。应用此系统,成功敲除长达50kb的次级代谢基因簇,并在多位点同时插入多拷贝的葡萄糖氧化酶Gox C,使其酶活提高到了基于传统方法改造株的4倍以上。上述构建的CRISPR-HDR平台为实验室的基因编辑技术以及下文的基因缺陷株的构建提供了工具基础;(2)黑曲霉b HLH型转录因子ino2作用机制以及其调控磷脂合成代谢的探究首次通过生物信息学的方法鉴定到黑曲霉来源b HLH型转录因子ino2(An02g04350),并通过EMSA和酵母双杂交工具确定了ino2的作用机制:与自身结合形成同源二聚体,并结合E-box基序“CASSTG”正向调控磷脂合成相关基因的转录。对ino2敲除株相对于野生型的比较转录组学研究发现,ino2基因的缺失会影响黑曲霉细胞壁代谢相关途径基因的转录,并且可以影响胆碱脱氢酶活性、脂肪酸合酶活性、脂类代谢过程以及铵离子跨膜转运。针对ino2基因缺陷株表型板观察以及不同基因集的分析显示,ino2是黑曲霉中调控磷脂代谢、脂肪酸合成以及内质网相关蛋白代谢的重要基因并且可以影响到细胞壁和DNA损伤修复系统。基于HPLC-MS/MS的研究发现,ino2的缺失会导致黑曲霉总PI含量下调,造成磷脂稳态失衡。(3)黑曲霉磷脂稳态失衡与内质网蛋白稳态失衡互相影响的研究首次通过生物信息学以及表型板观察的方法鉴定到黑曲霉中PE、PC和PA合成途径的关键基因cho2(An15g06310)、opi3(An08g00560)和dgk1(An02g09160),其缺失会导致黑曲霉磷脂稳态失衡。从黑曲霉磷脂稳态失衡株(Δino2、Δcho2、Δopi3和Δdgk1)以及内质网稳态失衡株(Δhac A和hac Ai)出发,基于HPLC-MS的脂质组学技术以及转录组学分析得出结论:黑曲霉总磷脂的稳态失衡会导致细胞内质网蛋白稳态失衡,黑曲霉内质网蛋白稳态失衡会导致总磷脂稳态失衡。