论文部分内容阅读
背景:骨缺损主要是骨骼受到严重撞击、创伤、肿瘤切除、骨关节炎等后遗症引起的骨损伤,是临床常见的骨科病变。骨缺损的修复主要通过骨移植方式的进行治疗。骨髓间充质干细胞BMMSCs自发现后,因其具有成骨分化的功能,由于BMMSCs取材比较简单,容易培养、无免疫排斥反应,近年已被广泛用于骨缺损临床治疗和试验研究。由于BMMSCs定向分化成骨的几率受到很多因素的影响,因此研究如何刺激BMMSCs向成骨转化的机制,具有重要的临床意义。目的:本研究通过microRNA-149甲基化及lncRNA-H19与microRNA-149的相互作用下调microRNA-149的表达,从而上调基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的表达,观察BMMSCs的成骨分化的效果,探讨如何下调microRNA-149的表达,上调SDF-1并刺激BMMSCs向成骨细胞转化的分子机制。方法:利用TargetScan和StarBase发现SDF-1是miR-149下游的靶基因,而H19是miR-149上游调控的lncRNA,并通过双荧光素酶报告基因分析技术验证miR-149与SDF-1及lncRNA的相互关系。膜诱导技术建立大鼠成骨分化模型,免疫组化检测骨膜H19、miR-149和SDF-1的表达;Von Kossa染色观察骨膜的钙沉积,PNP比色法检测大鼠骨膜ALP活性,ELISA检测OCN含量。分离大鼠BMMSCs进行成骨分化诱导,分别用甲基转移酶抑制剂Aza-CdR、SDF-1中和抗体、CXCR4拮抗剂AMD3100、H19、sh-SDF-1、miR-149 mimic、miR-149inhibitor等处理BMMSCs,检测钙化结节(Von Kossa染色)、矿化结节(茜素红S染色)、ALP和OCN等指标;流式细胞仪检测CD44、CD90、CD14和CD45等表面标志;Western blot检测ALP、OCN、RUNX2、OSX等蛋白的表达。结果:(1)成功建立大鼠成骨分化模型。与假手术比较,在第2周和第4周时大鼠成骨分化模型组的STRO-1蛋白表达、ALP活性和OCN含量显著升高(P<0.05)。分离BMMSCs,成功诱导其成骨分化。BMMSCs诱导成骨分化3周后,细胞形态由梭形变为多边形,可见钙盐结节。与对照组比较,骨分化诱导组ALP活性及OCN含量明显增强(P<0.05)。(2)生物信息学分显示SDF‐1的3′UTR与miR‐149序列之间有1个特定的结合区域。与对照组比较,miR-149明显抑制SDF-1-wt 3’-UTR的荧光素酶活性(P<0.05)。与对照组比较,miR-149 mimic组BMMSCs的SDF-1表达明显降低(P<0.05),而在miR-149 inhibitor组明显升高(P<0.05)。与对照组比较,miR-149inhibitor组BMMSCs的ALP活性、OCN含量、矿化结节和钙化结节数量、RUNX2和OSX蛋白表达明显升高,而miR-149 mimic组明显降低(P<0.05)。(3)与对照组比较,骨分化诱导组miR-149的甲基化水平较高,而在5-Aza-CdR组中,miR-149的甲基化水平较低(P<0.05);与DMSO组相比,第7、12天5-Aza-CdR组的miR‐149表达明显降低(P<0.05)。与骨分化诱导组相比,5-Aza-CdR组的ALP活性、OCN含量、CD44、CD90阳性率等明显降低(P<0.05)。(4)与对照组相比,骨分化诱导组、SDF-1中和抗体组和AMD3100组miR‐149表达明显下降(P<0.05)。与骨分化诱导组比较,SDF-1中和抗体组或AMD3100组的ALP活性、OCN含量、Nanog、Oct-4、Sox-2等表达均降低(P<0.05)。(5)生物信息学分析显示miR-149与H19有部分碱基互补;成骨分化大鼠模型骨膜的miR-149与H19的表达呈显著负相关(P<0.05)。与anti-IgG比较,anti-AGO2组H19和miR-149明显富集(P<0.05)。与对照组比较,成骨分化诱导组BMMSCs的H19表达明显升高(P<0.05)。与sh-H19组BMMSCs组比较,H19组BMMSCs的H19表达、钙化结节和矿化结节数量、ALP活性、OCN含量、RUNX2及OSX蛋白表达明显增加(P<0.05)。(6)与对照组相比,H19+miR-149mimic组BMMSCs的H19表达、ALP活性、OCN含量、钙化和矿化结节数量、RUNX2及OSX蛋白的表达下降,而H19+miR-149 inhibitor组升高(P<0.05)。与H19-NC组相比,H19组SDF-1表达、ALP活性、OCN含量、矿化结节、钙化结节、RUNX2、OSX表达等明显升高(P<0.05);与H19+sh-SDF-1-NC比较,H19+sh-SDF-1的SDF-1表达、ALP活性、OCN含量、矿化结节、钙化结节、RUNX2、OSX表达等明显升高降低(P<0.05)。结论:miRNA-149能够与SDF-1基因的3′UTR结合,下调成骨转化BMMSCs的SDF-1蛋白的表达,而miRNA-149基因启动子区的甲基化,下调胞质中miRNA-149的表达,进而上调SDF-1与CXCR4的表达,刺激BMMSCs的成骨分化,增加BMMSCs的钙化结节和矿化结节的形成,升高ALP活性和OCN含量。H19与miRNA-149基因相互作用,下调miRNA-149的表达,从而通过SDF-1/CXCR4通路,促进BMMSCs成骨分化。